海洋弧菌復(fù)蘇促進(jìn)因子家族糖蛋白酶的研究.pdf

1、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)廣泛分布于江湖河口及海洋環(huán)境,是引起水產(chǎn)動(dòng)物疾病的條件性致病菌,副溶血弧菌也是引起人食物中毒的重要病原菌。副溶血弧菌和哈維氏弧菌在不良環(huán)境形成活的非可培養(yǎng)(VBNC)狀態(tài),條件適宜時(shí)復(fù)蘇為可培養(yǎng)形式,引起動(dòng)物疾病,但有關(guān)細(xì)菌復(fù)蘇的機(jī)制仍不清楚。藤黃微球菌細(xì)胞復(fù)蘇促進(jìn)因子(Rpf)的發(fā)現(xiàn)是研究休眠菌復(fù)蘇機(jī)制的一個(gè)重大突破,微量的Rpf能

2、有效促進(jìn)休眠微球菌的復(fù)蘇以及生活狀態(tài)細(xì)菌的增殖。有關(guān)弧菌細(xì)胞復(fù)蘇促進(jìn)因子家族蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究報(bào)道較少,本文對(duì)副溶血弧菌和哈維氏弧菌的Rpf家族的糖蛋白酶(Gcp)基因進(jìn)行克隆、表達(dá),并構(gòu)建哈維氏弧菌gcp基因突變株,對(duì)表達(dá)Gcp生物學(xué)功能及突變株性質(zhì)進(jìn)行研究,為進(jìn)一步探索海洋弧菌VBNC狀態(tài)的形成和復(fù)蘇機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 從副溶血弧菌、哈維氏弧菌基因組中克隆的gcp基因由702 bp組成,編碼233個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì),都

3、不含有明顯的信號(hào)肽和跨膜蛋白結(jié)構(gòu)域。副溶血弧菌8621.4的Gcp與其他副溶血弧菌菌株、哈維氏弧菌、溶珊瑚弧菌、擬態(tài)弧菌、費(fèi)氏弧菌、殺鮭弧菌等的糖蛋白酶的氨基酸序列相似性為67％-100％,與變形桿菌和沙門氏菌復(fù)蘇促進(jìn)因子的相似性分別為55％和57％,與耶爾森氏菌的M22肽酶YeaZ的相似性為55％。哈維氏弧菌SF-1的Gcp序列與其他哈維氏弧菌菌株、溶藻膠弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶珊瑚弧菌、霍亂弧菌、梅氏弧菌和燦爛弧菌等糖蛋白酶的

4、氨基酸序列相似性分別為69％-98％,與大腸桿菌糖蛋白酶的序列相似性為58％-59％。
　　 將副溶血弧菌8621.4和哈維氏弧菌SF-1的gcp基因克隆于原核表達(dá)載體,在大腸桿菌中表達(dá),采用Ni親和層析柱純化的Gcp為單一的蛋白帶。利用純化的副溶血弧菌8621.4表達(dá)Gcp免疫新西蘭大白兔制備特異性抗體,Western-blotting方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)正常生長(zhǎng)的副溶血弧菌8621.4和哈維氏弧菌SF-1胞內(nèi)表達(dá)Gcp蛋白,在培養(yǎng)上

5、清中檢測(cè)不到表達(dá)的Gcp,分子量約為27 kDa,與已報(bào)道其他細(xì)菌的Rpf分子量相近；VBNC狀態(tài)誘導(dǎo)過程中(低溫寡營(yíng)養(yǎng))的副溶血弧菌8621.4和哈維氏弧菌SF-1菌體也能特異性表達(dá)該蛋白,而在VBNC狀態(tài)的副溶血弧菌菌體中檢測(cè)到2條特異表達(dá)蛋白帶,其中一條蛋白的分子量約為27 kDa,另一條蛋白的分子量約為54 kDa,推測(cè)其為Gep蛋白的二聚體。研究發(fā)現(xiàn)哈維氏弧菌SF-1表達(dá)的Gcp蛋白對(duì)正常生活狀態(tài)下SF-1的促生長(zhǎng)作用非常顯著