海洋弧菌QY105中褐藻膠裂解酶的研究.pdf

1、隨著人類對資源的需求量日益增加，造成地球能源接近枯竭，所以各國政府開始關(guān)心重視新能源的開發(fā)利用。在新能源中生物能源備受關(guān)注，從海藻中獲得生物能源以其不占用土地，不爭用糧食供給，不需潔凈水源，不使用肥料等優(yōu)點而更為突出。并且在一些國家，褐藻已經(jīng)進行了大規(guī)模的養(yǎng)殖，每年產(chǎn)生褐藻干重1500萬公噸，我省僅榮成市年均生產(chǎn)鮮海帶可達100余萬噸，就為褐藻產(chǎn)生生物能源提供了豐富的原料。
　　褐藻主要有三種組成成分：葡萄糖、甘露醇和褐藻膠，大腸

2、桿菌自身可以利用葡萄糖和甘露醇，卻無法利用褐藻膠。褐藻膠是由β-D-甘露糖醛酸（β-D-mannuronate acid，M）及其C5差向異構(gòu)體α-L-古羅糖醛酸（α-L-guluronate acid，G）兩種糖醛酸單體通過1，4糖苷鍵聚合而成的一種水溶性酸性多糖。褐藻膠的聚合方式有三種：由多聚β-D-甘露糖醛酸構(gòu)成均聚物（polyM）；由多聚α-L-古羅糖醛酸構(gòu)成均聚物（ployG）；由β-D-甘露糖醛酸與α-L-古羅糖醛酸組成的M

3、G隨機交替片段（polyMG）。
　　褐藻膠裂解酶能以β消除方式催化降解褐藻膠，在非還原性末端生成帶有C4,5雙鍵的4-deoxy-L-erythro-hex-4-enopyranosyluronic acid結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)在230-240 nm下有強烈的吸收峰。褐藻膠裂解酶根據(jù)其降解底物專一性的不同可分為三類：專一性裂解polyM片段的裂解酶（EC4.2.2.3），專一性裂解polyG片段的裂解酶（EC4.2.2.11），以及兩種

4、片段都可裂解的雙功能裂解酶。目前發(fā)現(xiàn)的褐藻膠裂解酶多具有 polyM底物偏好性，為了更好更徹底的降解利用褐藻，發(fā)現(xiàn)具有polyG底物偏好性的褐藻膠裂解酶及研究褐藻膠寡糖酶具有重要意義。
　　本文篩選得到產(chǎn)酶高，且具有 polyG底物偏好性的菌株，命名為 QY105。通過16S rDNA基因序列比對確定QY105為弧菌屬，即Vibrio sp. QY105。
　　QY105發(fā)酵周期短，在發(fā)酵到15 h時，發(fā)酵上清中具有poly

5、G底物偏好性的褐藻膠裂解酶酶活幾乎達到最高酶活的90％，發(fā)酵20 h即可達到最高酶活。其發(fā)酵上清經(jīng)過硫酸銨沉淀、疏水層析、離子交換層析三步分離純化即可達到電泳純水平，其分子量為37 kDa。AlyV5的得率為7.5%，被濃縮了23.6倍，比活力為2152 U/mg。
　　AlyV5最適溫度為38℃，在pH7.0的Tris-HCl緩沖體系中酶活最高。AlyV5在60℃保溫1 h或90℃保溫10 min后，其剩余酶活可達到原來的40%

6、。AlyV5在pH6.0-9.0的緩沖體系中4℃存放12 h后仍保持80%的酶活力。NaCl對酶活有明顯的促進作用，沒有NaCl的反應(yīng)體系中幾乎測不到酶活；K+、Li+、NH4+對于酶的活性無明顯影響；Mg2+、Ca2+、Mn2+對酶活有促進作用，Cu2+、Fe3+對于該酶的活性有明顯的抑制作用；其余金屬離子對 AlyV5的酶活力有不同程度的抑制作用；而1 mM的SDS對于酶活的影響不大，EDTA卻明顯抑制AlyV5的酶活力。
　

7、　在底物特異性研究中，AlyV5對 polyG具有偏好性，但同時也可以降解polyM，并且降解polyG的終產(chǎn)物主要為二、三、四糖，而降解polyM最終產(chǎn)物主要為三、四、五糖。因此，AlyV5所能降解的最小寡糖為 polyG的五糖單元及polyM的六糖單元。將其與polyM偏好性褐藻膠裂解酶混合使用，測得的酶活比混合后的理論值高出2倍。
　　為了進一步研究褐藻膠的代謝過程，在研究了褐藻膠裂解酶AlyV5的性質(zhì)后，我們對其內(nèi)部的褐藻