新型分泌蛋白Canopy2在結(jié)直腸腺癌生長和發(fā)展中的作用研究.pdf

1、目的：
　　近年來腫瘤的發(fā)病率和死亡率一直呈現(xiàn)持續(xù)增高的趨勢，其中血管生成（angiogenesis）是腫瘤生長和發(fā)展的一個重要促進(jìn)因素。正常情況下，機(jī)體內(nèi)促血管生成與抑制血管生成因子之間保持一種動態(tài)平衡，維持血管系統(tǒng)的正常狀態(tài)來保持機(jī)體各組織器官正常的營養(yǎng)所需。在腫瘤發(fā)展過程中，由于各種原因?qū)е履[瘤細(xì)胞過度增生，為了滿足營養(yǎng)所需，大量的新生血管在瘤體組織中產(chǎn)生，以供給所需的營養(yǎng)物質(zhì)，促血管生成因子在此過程發(fā)揮重要的作用。已有研究

2、表明，抑制腫瘤的血管生成，可以有效抑制腫瘤的生長，發(fā)揮一定的抗腫瘤作用?？鼓[瘤血管生成已成為腫瘤治療的新型靶點(diǎn)之一。近期研究表明，Canopy2（CNPY2）是一種新型的分泌型促血管生成因子，具有促進(jìn)主動脈環(huán)新生血管發(fā)生和生長的效果。因此，CNPY2可能通過促血管生成作用而參與在腫瘤的發(fā)生發(fā)展。結(jié)直腸癌（colorectal carcinoma，CRC）是人類腫瘤的一類高發(fā)類型，最新數(shù)據(jù)顯示其發(fā)病率和死亡率分別占據(jù)腫瘤疾病的第三和第四位

3、。與其他各類型腫瘤相同，目前結(jié)腸癌的發(fā)病和生長機(jī)制仍未明確。課題組在研究中發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者的癌組織和血漿中，CNPY2水平顯著增高，提示CNPY2可能參與結(jié)直腸癌生長和發(fā)展，但是確切作用和影響尚不清楚。
　　因此，本課題針對結(jié)直腸癌，研究了CNPY2在結(jié)腸癌生長和發(fā)展中的作用研究。通過使用結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞，knockdown細(xì)胞CNPY2水平，分別在體外細(xì)胞和體內(nèi)移植瘤中開展CNPY2在結(jié)直腸癌生物學(xué)活性的作用研究，包括腫瘤

4、的生長、遷移/浸潤和凋亡，綜合評價CNPY2作為結(jié)直腸癌的臨床預(yù)防或預(yù)后評價指標(biāo)及治療新靶點(diǎn)的開發(fā)應(yīng)用價值。
　　方法：
　　1.檢測臨床結(jié)直腸癌患者CNPY2表達(dá)水平
　　隨機(jī)選取臨床結(jié)直腸癌患者，在患者進(jìn)行手術(shù)切除腫瘤的治療的過程中，收集患者的癌組織和癌旁正常組織（距癌組織>15cm）樣品，以及結(jié)直腸腺癌患者術(shù)前和正常健康人的血漿樣品。組織進(jìn)行RNA、蛋白提取或福爾馬林固定制備石蠟包塊，分別進(jìn)行人 CNPY2的 R

5、T-PCR、 Western blotting檢測和免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）染色。通過ELISA法，測定血漿CNPY2蛋白的水平。
　　2.構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shRNA質(zhì)粒的HCT116細(xì)胞系
　　通過shRNA（short hairpin RNA）knockdown細(xì)胞內(nèi)源性CNPY2基因表達(dá)的方式，選擇質(zhì)粒pRFP-C-RS-shRNA-human CNPY2和pRFP-C-RS-shR

6、NA-control，采取Lipo2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞116（human colorectal tumor cell116，HCT116細(xì)胞）。細(xì)胞培養(yǎng)中采取嘌呤霉素（0.5ug/ml）篩選21天，隨后有限稀釋法進(jìn)行挑選單個陽性表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞、擴(kuò)增，獲得單細(xì)胞克隆。提取細(xì)胞RNA、蛋白和培養(yǎng)上清，分別進(jìn)行RT-PCR、Western blotting和ELISA，檢測細(xì)胞內(nèi)源性CNPY2 knockdown的效率。最終成功

7、構(gòu)建兩種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shRNA質(zhì)粒的細(xì)胞系：HCT116shRNA-CNPY2細(xì)胞和HCT116shRNA-control細(xì)胞。
　　3.檢測CNPY2對HCT116細(xì)胞部分生物學(xué)活性的影響
　　利用構(gòu)建的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系HCT116shRNA-CNPY2細(xì)胞和HCT116shRNA-control細(xì)胞，分別采用CCK8細(xì)胞計(jì)數(shù)法、克隆形成、劃痕愈合試驗(yàn)、細(xì)胞AnnexinV和PI雙染流式計(jì)數(shù)的方法，觀察CNPY2在HCT116細(xì)

8、胞的生長、遷移和凋亡的作用。
　　4.CNPY2對裸鼠移植瘤生長的影響
　　裸鼠皮下等位注射HCT116shRNA-CNPY2細(xì)胞和HCT116shRNA-control細(xì)胞，觀察和記錄移植瘤生長情況。21天后，收集移植瘤，測量瘤體大小、重量反映移植瘤生長情況。移植瘤用于制備石蠟包塊、切片，分別進(jìn)行增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、CD105和TUNEL染色，反

9、映CNPY2在瘤體增殖、血管生成和凋亡的影響。
　　結(jié)果:
　　1.CNPY2在結(jié)直腸癌癌組織水平明顯高于癌旁正常組織（p<0.01），并且CNPY2的來源主要是癌細(xì)胞分泌的；患者血漿CNPY2水平是正常健康人的1.72倍（p<0.01）。
　　2.成功構(gòu)建了抑制HCT116細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)源性CNPY2表達(dá)的shRNA質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系HCT116shRNA-CNPY2細(xì)胞及對照細(xì)胞系HCT116shRNA-control

10、細(xì)胞。
　　3.體外knockdown CNPY2后，引起細(xì)胞增殖和遷移的減弱，而促進(jìn)化療藥奧沙利鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　4.體內(nèi)瘤體CNPY2的抑制，降低了移植瘤的生長速度和血管生成情況，增加了瘤體的凋亡。
　　結(jié)論：
　　在結(jié)直腸癌的癌組織中癌細(xì)胞高表達(dá)CNPY2，導(dǎo)致癌組織和患者血漿CNPY2水平明顯高于正常組織和健康人群，提示CNPY2參與結(jié)直腸癌生長和發(fā)展。通過HCT116細(xì)胞中開展CNPY2作用研究，