結(jié)直腸腺癌中神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞克隆性起源的研究.pdf

1、結(jié)直腸癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，而神經(jīng)內(nèi)分泌分化(neuroendocrinedifferentiation，NED)廣泛存在于一般的非內(nèi)分泌組織、良性腫瘤及惡性腫瘤組織中。結(jié)直腸腺癌中NED的發(fā)生率約為41.5％。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)伴神經(jīng)內(nèi)分泌分化腺癌的研究?jī)H限于腺癌細(xì)胞，而對(duì)于散在的NE細(xì)胞研究較少，特別是用分子遺傳學(xué)方法研究腺癌中單個(gè)NE細(xì)胞的起源方面尚未見(jiàn)報(bào)道，NE細(xì)胞是否存在染色體及相關(guān)基因表達(dá)水平的改變，它們是否為腫瘤的一種

2、成分，尚不清楚。近年來(lái)，關(guān)于腺癌中NE細(xì)胞組織起源的問(wèn)題主要存在兩種不同的假說(shuō)。一種假說(shuō)認(rèn)為，腺癌細(xì)胞和NE細(xì)胞分別起源于多潛能干細(xì)胞和原發(fā)性神經(jīng)內(nèi)分泌癌;另一種假說(shuō)認(rèn)為，腺癌細(xì)胞和NE細(xì)胞均來(lái)源于內(nèi)胚層多潛能干細(xì)胞，在腫瘤發(fā)生及演進(jìn)過(guò)程中，內(nèi)胚層的多能干細(xì)胞受激素、局部微環(huán)境及基因組不穩(wěn)定性的影響，使某些被調(diào)節(jié)基因抑制的基因組密碼發(fā)生隨機(jī)脫抑制，在RNA轉(zhuǎn)錄水平選擇性的激活兩種以上的調(diào)節(jié)基因，產(chǎn)生雙向或多向分化。明確結(jié)直腸腺癌中NE細(xì)

3、胞的起源，將有助于更深入地認(rèn)識(shí)伴神經(jīng)內(nèi)分泌分化結(jié)直腸腺癌的發(fā)生、發(fā)展的機(jī)理，從而有針對(duì)性的治療，這對(duì)于提高結(jié)直腸腺癌患者生存率及生存質(zhì)量具有重要意義。
　　 目前在腫瘤分子生物學(xué)研究中國(guó)際上很多研究都利用激光捕獲顯微切割(Laser capture microdissection， LCM)技術(shù)獲取目的細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞數(shù)量有限的樣本則進(jìn)行全基因組擴(kuò)增以獲得足量DNA。激光捕獲顯微切割技術(shù)可以使研究者獲得形態(tài)完整的單一細(xì)胞或細(xì)胞群進(jìn)行

4、遺傳學(xué)研究，解決了構(gòu)成復(fù)雜的組織中捕獲目的細(xì)胞的難題。使用該技術(shù)即可避免鄰近細(xì)胞的污染，又由于在切除和提取細(xì)胞過(guò)程中不產(chǎn)生熱量，對(duì)目的細(xì)胞沒(méi)有任何損傷。全基因組擴(kuò)增依據(jù)多重置換擴(kuò)增（multiple displacement amplification，MDA）原理，采用Phi29 DNA聚合酶，保證了擴(kuò)增片段的高保真性。
　　 干細(xì)胞在分化過(guò)程中，染色體有絲分裂不均衡，可造成部分基因在兩種分化的細(xì)胞中同時(shí)出現(xiàn)等位基因的改變（如

5、擴(kuò)增、丟失、突變等），根據(jù)這一理論可通過(guò)檢測(cè)微衛(wèi)星改變（包括微衛(wèi)星不穩(wěn)定和雜合性丟失）及突變等來(lái)推測(cè)組織細(xì)胞的克隆性起源。
　　 我們采用嗜鉻素A(CgA)標(biāo)記新鮮結(jié)直腸腺癌組織中NE細(xì)胞，以激光捕獲顯微切割儀切割目的細(xì)胞，應(yīng)用DNA抽提和全基因組擴(kuò)增，在全基因組范圍內(nèi)選取多個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，通過(guò)檢測(cè)NE細(xì)胞和腺癌細(xì)胞的微衛(wèi)星不穩(wěn)定、雜合性缺失并聯(lián)合p53突變的檢測(cè)，對(duì)結(jié)直腸腺癌中NE細(xì)胞進(jìn)行分子水平的研究，以期探討NE細(xì)胞的克隆性

6、起源。
　　 材料和方法：
　　 本實(shí)驗(yàn)收集浙江省諸暨市人民醫(yī)院2008-2009年間56例結(jié)直腸腺癌新鮮腫瘤標(biāo)本及距離腫瘤2cm以上正常組織各一塊。首先用冰凍切片-CgA免疫組織化學(xué)染色，檢出30例伴神經(jīng)內(nèi)分泌分化結(jié)直腸腺癌標(biāo)本，用激光捕獲顯微切割儀切割NE細(xì)胞，每一例樣本捕獲200個(gè)左右單個(gè)NE細(xì)胞。應(yīng)用DNA Micro-kit抽提試劑盒及Repli-g全基因組擴(kuò)增試劑盒對(duì)捕獲的NE細(xì)胞進(jìn)行DNA抽提和全基因組放大

7、以獲得大量DNA，在全基因組范圍內(nèi)選取26個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，結(jié)合PCR-SSCP-銀染色檢測(cè)腺癌細(xì)胞和NE細(xì)胞微衛(wèi)星不穩(wěn)定、雜合性缺失，聯(lián)合PCR-測(cè)序檢測(cè)p53基因突變發(fā)生情況，推測(cè)結(jié)直腸腺癌中NE細(xì)胞的克隆性起源。另外，結(jié)合臨床病理資料，綜合分析微衛(wèi)星改變和p53基因突變的臨床病理意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、免疫組化-激光顯微切割結(jié)果:56例結(jié)直腸腺癌新鮮標(biāo)本中檢出30例伴神經(jīng)內(nèi)分泌分化的樣本，在20倍物鏡下進(jìn)行激光

8、顯微切割，每個(gè)腺癌樣本捕獲了200個(gè)左右單個(gè)NE細(xì)胞。
　　 2、微衛(wèi)星結(jié)果分析:30例樣本MSI總發(fā)生率為16.9％，LOH總發(fā)生率為8.5％，各樣本MSI發(fā)生率高于LOH。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，樣本中腺癌細(xì)胞和NE細(xì)胞的MSI及LOH發(fā)生率一致。30例樣本中，第3、5、16、18、24、26例樣本在NE細(xì)胞和腺癌細(xì)胞中發(fā)生了完全一致的微衛(wèi)星改變，其余24例樣本均有不同程度的MSI及LOH一致性。樣本中兩種細(xì)胞微衛(wèi)星改變一致性與不一致

9、性的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。
　　 3、p53突變情況:30例樣本p53總突變率為16.7％。 p53突變出現(xiàn)在外顯子5、7和8。第1、4、14、15、27例樣本中NE細(xì)胞和腺癌細(xì)胞均發(fā)生了一致的p53突變。
　　 4、微衛(wèi)星改變、p53突變與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系:微衛(wèi)星改變發(fā)生率與結(jié)直腸腺癌的分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05）。p53突變與結(jié)直腸癌TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(