miRNA-345在肝細(xì)胞性肝癌中的功能及作用機(jī)制的研究.pdf

1、背景：
　　肝細(xì)胞性肝癌是世界上癌癥相關(guān)性死亡的第三大原因(1)，被稱為“癌中之王”。雖然近年來治療方法有所提高，然而，肝癌的復(fù)發(fā)率以及死亡率依然在日漸提升，且未實(shí)現(xiàn)理想預(yù)后。對于肝癌而言，導(dǎo)致其高致死率的關(guān)鍵因素為肝癌的轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)。因?yàn)楝F(xiàn)今尚未明晰其具體的作用機(jī)制，所以，從基因分子水平對肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移機(jī)制展開研究是必要的，同時實(shí)施早期預(yù)防以及有效的治療對策，突破當(dāng)前存在于增強(qiáng)肝癌病人療效、改善肝癌病人預(yù)后方面的瓶頸。
　

2、　MircoRNAs(縮寫為miRNAs)屬于單鏈非編碼小分子RNA，其大量存在于真核生物內(nèi)，為內(nèi)源性基因，長度達(dá)20-23個堿基。miRNAs在同靶基因mRNA的3'UTR（3'-端非翻譯區(qū)）兩者發(fā)生反應(yīng)時，前者調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄靶基因的水平，由此對細(xì)胞代謝、分化、增殖以及凋亡等行為施加影響。異常表達(dá)的miRNAs在很大程度上影響包括惡性腫瘤在內(nèi)的若干類疾病，在腫瘤的整個生命周期發(fā)揮致癌基因（或者抑癌基因）功能。在過去的幾年內(nèi)，公眾開始日漸重視

3、miRNAs同腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移兩者之間的相關(guān)性，前者經(jīng)由對影響腫瘤細(xì)胞血管生成、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、基質(zhì)降解以及黏附等行為的相關(guān)基因加以調(diào)節(jié)，來釋放自身效能，當(dāng)前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)出同轉(zhuǎn)移相關(guān)的眾多miRNAs分子。與正常組織相比，miR-345在惡性間皮瘤中高度表達(dá)(5)。此外，miR-345表達(dá)增加，可能在口腔惡性轉(zhuǎn)化中起關(guān)鍵作用(6)。miR-345通過靶向多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MRP1）(7)與MCF-7的順鉑抗性相關(guān)。在結(jié)直腸癌中，miR-3

4、45的低表達(dá)賦予淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和更差的組織學(xué)類型，并且其表達(dá)水平的恢復(fù)能夠抑制癌細(xì)胞增殖和侵襲(8,9)。同時，miR-345表達(dá)水平在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中下調(diào)，其低表達(dá)與臨床惡性程度和預(yù)后不良相關(guān)(10)。據(jù)報道m(xù)iR-345的缺失賦予胰腺癌(PC)細(xì)胞凋亡抗性(11)，miR-345通過抑制Smad1抑制前列腺癌細(xì)胞增殖和遷移(12)，尚有少量研究報告了miR-345和HCC之間的相關(guān)性。Shiu(3)等報道丙型肝炎病毒(HCV

5、)核心蛋白可上調(diào)miR-345的表達(dá)，miR-345通過在Huh7細(xì)胞中靶向p21抑制姜黃素誘導(dǎo)的凋亡程序，Jiang等人的研究表明，具有良好生存率的HCC患者與存活率差的病例相比具有高miR-345表達(dá)水平(14)。因此，值得研究miR-345及其在HCC中的基礎(chǔ)機(jī)制的生物學(xué)作用。
　　但是miR-345是否參與肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移？在肝癌轉(zhuǎn)移以及侵襲過程中，miR-345是否由mTOR/STAT3/AKT渠道（由IRF1介導(dǎo)）來對

6、EMT加以抑制得以實(shí)現(xiàn)的？以對miR-345為靶點(diǎn)的治療是否能逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移？因此，應(yīng)從更深層次來探討與分析在肝癌發(fā)展中miR-345的作用機(jī)制。
　　目的：
　　研究肝癌轉(zhuǎn)移與侵襲中miR-345所具備的抑制功能，以分子機(jī)制為基礎(chǔ)，對肝癌轉(zhuǎn)移和侵襲過程做出新的解釋，以miRNA為基礎(chǔ)治療肝癌提供新的理論依據(jù)。
　　方法：
　　1、通過PCR技術(shù)檢測肝癌組織與癌旁組織、肝癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的miRNA-3

7、45的表達(dá)水平，分析miRNA-345表達(dá)水平的差異與肝癌細(xì)胞侵襲能力關(guān)系。
　　2、將miR-345模擬物(HmiR0210-MR04)、抑制劑(HmiR-AN0437-AM04)分別轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，從而過表達(dá)或抑制肝癌細(xì)胞中miR-345的水平，觀察肝癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的變化。
　　3、構(gòu)建miR-345過表達(dá)載體，并注入到裸鼠體內(nèi)。通過裸鼠肝癌肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，觀察miR-345過表達(dá)對肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響。<

8、br>　　4、構(gòu)建miR-345和miR-345+IRF1（干擾素調(diào)節(jié)因子1）過表達(dá)肝細(xì)胞性肝癌模型，通過肝癌細(xì)胞不同的生物學(xué)行為和蛋白的表達(dá)水平，來研究miR-345對IRF1（干擾素調(diào)節(jié)因子1）介導(dǎo)的mTOR/STAT3/AKT(雷帕霉素靶蛋白/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活化因子3/蛋白激酶B)信號通路對EMT（上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化）的影響。
　　結(jié)果：
　　1、在肝癌組織和肝癌細(xì)胞中miRNA-345表達(dá)水平明顯低于癌旁正常組織及正常肝細(xì)胞(

9、P＜0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miR-345的表達(dá)與肝癌患者的多個腫瘤淋巴結(jié)，靜脈浸潤和晚期腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(TNM)階段呈負(fù)相關(guān)性(P＜0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2、使用ChIP技術(shù)檢測肝癌組織和肝癌細(xì)胞中miRNA-345啟動子區(qū)域組蛋白H3和H4的乙?；剑Y(jié)果顯示在健康肝組織和正常肝細(xì)胞中miRNA-345啟動子區(qū)域組蛋白H3的乙?；矫黠@高于肝癌組織和肝癌細(xì)胞，p＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而H4的乙酰化未發(fā)生明

10、顯變化。miRNA-345啟動子區(qū)域組蛋白H3的乙?；胶蚼iRNA-345的表達(dá)成正相關(guān)。
　　3、在健康肝臟組織中IFR1mRNA的表達(dá)水平明顯低于于肝癌組織，存在顯著差異性(P＜0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從肝癌細(xì)胞的數(shù)據(jù)表明，miR-345的過表達(dá)可以顯著下調(diào)IRF1的表達(dá)(P＜0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過Spearman秩相關(guān)分析，miR-345表達(dá)水平與肝癌細(xì)胞標(biāo)本中的IRF1mRNA水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.415

11、，P＜0.05)。
　　4、轉(zhuǎn)染HmiR0210-MR04的肝癌細(xì)胞SMMC-7721中miRNA-345對比正常肝臟組織的表達(dá)明顯增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。Western blot檢測mTOR/STAT3/AKT通路中mTOR、STAT3、AKT蛋白的表達(dá)對比正常肝臟組織明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。檢測EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、Claudin-1、N-cadherin和snail的表達(dá)對比正常肝臟

12、組織，E-cadherin蛋白的表達(dá)明顯增高、Claudin-1、N-cadherin和snail蛋白降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。miR-345的過表達(dá)對mTOR/STAT3/AKT信號通路與EMT具有抑制作用。
　　5、轉(zhuǎn)染HmiR-AN0437-AM04的肝癌細(xì)胞HepG2中miRNA-345對比正常肝臟組織的表達(dá)明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。Western blot檢測mTOR/STAT3/AKT通路中mT

13、OR、STAT3、AKT蛋白的表達(dá)對比正常肝臟組織明顯增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。檢測EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、Claudin-1、N-cadherin和snail的表達(dá)對比正常肝臟組織，E-cadherin蛋白的表達(dá)明顯降低、Claudin-1、N-cadherin和snail蛋白增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。干擾miR-345的表達(dá)對mTOR/STAT3/AKT信號通路與EMT具有促進(jìn)作用。
　　6、R

14、apamycin處理SMMC-7721抑制mTOR/STAT3/AKT通路，對mTOR、STAT3、AKT的表達(dá)明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。使用Western blot技術(shù)檢測EMT相關(guān)蛋白Claudin-1、E-cadherin、N-cadherin和snail蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示E-cadherin蛋白的表達(dá)明顯降低;Claudin-1、N-cadherin和snail蛋白增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。mTOR/ST

15、AT3/AKT信號通路對肝癌細(xì)胞EMT過程具有正向的影響力，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。
　　7、IFR1可解除miRNA-345對mTOR/STAT3/AKT通路蛋白的表達(dá)的抑制作用。對肝細(xì)胞腫瘤侵襲力的促進(jìn)作用。
　　8、轉(zhuǎn)染空載體的SMMC-7721細(xì)胞株感染后裸鼠后，腫瘤體積每日增長明顯大于感染轉(zhuǎn)染miR0210-MR04的細(xì)胞株SMMC-7721，腫瘤體積差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腫瘤肺轉(zhuǎn)移的情況明顯高于感染了轉(zhuǎn)染m