miRNA-146a在人正常軟骨細胞壓力損傷模型中的功能及機制研究.pdf

1、miRNA-146a是最早發(fā)現(xiàn)的與骨性關節(jié)炎相關的差異性 miRNA。我們通過miRNA芯片技術研究發(fā)現(xiàn)其在急性壓力損傷后的軟骨細胞中表達也會上調(diào)。然而miRNA-146a在軟骨細胞壓力損傷中的作用尚不清楚。本研究的目的就是希望找到miRNA-146a的靶基因,并闡明其在軟骨細胞壓力損傷中的作用機制。
　　miRNA芯片技術研究顯示,相對于正常軟骨細胞,壓力損傷后的軟骨細胞miRNA-146a表達上調(diào),采用關聯(lián)分析的方法,發(fā)現(xiàn)生物

2、信息學分析預測的miRNA-146a的靶基因SMAD4,在聯(lián)合應用的全基因組基因芯片結果中低表達。因此,我們推測miRNA-146a通過SMAD4介導的方式來調(diào)控軟骨細胞的壓力損傷。
　　研究目的:
　　在這一假設的基礎上,本實驗擬通過研究闡明 miRNA-146a在軟骨細胞壓力損傷中的調(diào)控作用及其分子機制;證明SMAD4是miRNA-146a的直接靶基因,并參與介導 miRNA-146a對軟骨細胞壓力損傷的調(diào)控。我們希望此

3、研究可以為臨床上急性關節(jié)損傷的治療帶來新的研究思路和切入點。
　　研究方法:
　　1.原代分離及培養(yǎng)人軟骨細胞和骨性關節(jié)炎細胞,使用光鏡下觀察其生長情況,MTT法繪制生長曲線,采用甲苯胺藍染色、II型膠原免疫組化染色等方法對比兩種細胞的差別。
　　2.研制一套具有自主知識產(chǎn)權的實用多功能細胞壓力加載系統(tǒng),為進行細胞力學相關實驗奠定基礎。使用該系統(tǒng)構建軟骨細胞壓力損傷模型,力求盡量模擬高能損傷的力學特點。
　　3.

4、聯(lián)合應用miRNA芯片和全基因組基因芯片篩選正常及壓力損傷后軟骨細胞的差異miRNA和基因。采用Realtime RT-PCR分析的方法,驗證壓力損傷組特異性高表達的miRNA-146a表達情況是否與芯片結果一致,采用Realtime RT-PCR的方法及Western Blot的方法,驗證芯片結果中SMAD4和VEGF的差異表達。
　　4.通過向細胞內(nèi)轉染miRNA-146a的模擬物、抑制物、無關序列和空白對照組的方式,調(diào)控mi

5、RNA-146a的表達,進一步研究其功能。
　　5.觀察調(diào)控miRNA-146a的表達后,對軟骨細胞生物學特性的影響,并使用實時定量RT-PCR和Western-blot檢測各組中SMAD4和VEGF的表達情況。
　　6.觀察miRNA-146a的上調(diào)和下調(diào)后對軟骨細胞壓力損傷作用的影響
　　7.采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)證明SMAD4的mRNA3’UTR和miRNA-146a之間可以直接結合,驗證了SMAD4是miR

6、NA-146a的直接靶基因。
　　研究結果:
　　1.通過細胞表型和生物學活性的檢測,保證原代培養(yǎng)所得細胞為狀態(tài)良好的軟骨細胞,可以進行下一步實驗。
　　2.根據(jù)對比MTT等試驗結果,選擇對細胞生物學特性影響加大,且大部分存活的參數(shù),10Mpa60min作為成模參數(shù)。
　　3.miRNA-146a是芯片結果中差異最顯著的一個,聯(lián)合基因芯片結果并根據(jù)生物信息學方法預測其靶基因,找出了在芯片結果中與預測結果相一致的潛

7、在靶基因SMAD4,并成功驗證了芯片結果。
　　4.轉染外源性miRNA-146a mimics后,人正常軟骨細胞中miRNA-146a的表達水平顯著上升。轉染外源性miRNA-146a inhibitor后,人正常軟骨細胞中miRNA-146a的表達水平顯著下調(diào)。
　　5.在正常人軟骨細胞中上調(diào)miRNA-146a的表達,可以使SMAD4的表達下調(diào)并使VEGF的表達上調(diào),miRNA-146a的表達下調(diào)時可引起相反的作用。<

8、br>　　6.實驗結果顯示miRNA-146a具有抑制細胞增殖,促進壓力損傷軟骨細胞的凋亡的能力。
　　7.SMAD4是miRNA-146a的直接靶基因。
　　研究結論:
　　1.軟骨細胞壓力損傷后,miRNA-146a的表達升高,SMAD4表達下調(diào)而VEGF的表達升高。
　　2.SMAD4是miRNA-146a的直接靶基因。
　　3.miRNA-146a可以通過SMAD4介導的方式調(diào)控VEGF的表達,具有