ADAMTS5在肝細胞性肝癌中的表達及其作用機制的研究.pdf

1、背景：
　　肝細胞性肝癌（HCC)是肝臟最常見的原發(fā)惡性腫瘤,具有較高的發(fā)病率和致死率。由于其容易轉(zhuǎn)移復發(fā)的特點，HCC患者常表現(xiàn)為預后不良。因此，我們需要進一步研究肝細胞性肝癌的分子生物學機制，為其診斷和治療提供新的策略。
　　含I型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶5(ADAMTS5)，與基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）和解聚蛋白樣金屬蛋白酶（ADAM）同屬 Zn2+依賴的金屬蛋白酶家族。其異常表達在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重

2、要作用。關(guān)于其蛋白結(jié)構(gòu)的研究顯示，ADAMTS5除具有蛋白聚糖酶的活性外，更具有抗血管生成的作用。因此研究ADAMTS5在HCC中的表達及其作用機制具有重要意義。
　　rs2830585是位于編碼ADAMTS5的TSP重復序列1（TSR1）結(jié)構(gòu)域的基因序列中的非同義單核苷酸多態(tài)性位點（nsSNP），SNPs3D軟件預測結(jié)果顯示rs2830585可通過改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列從而影響ADAMTS5的功能，而TSR1結(jié)構(gòu)域是ADAMTS

3、5發(fā)揮抗血管生成活性的關(guān)鍵。因此，對于以豐富腫瘤血管生成為重要特征的的肝細胞性肝癌，研究ADAMTS5 rs2830585單核苷酸多態(tài)性與肝細胞性肝癌腫瘤易感性之間的關(guān)系具有重要意義。
　　目的：
　　1、檢測ADAMTS5在肝細胞性肝癌中的表達情況及其與臨床病理因素之間的關(guān)系。
　　2、闡明ADAMTS5在肝細胞性肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機制。
　　3、明確ADAMTS5 rs2830585單核苷酸多態(tài)性與肝細胞

4、性肝癌腫瘤易感性之間的關(guān)系。
　　方法：
　　第一部分、ADAMTS5在肝細胞性肝癌中的表達及其意義
　　1、采用肝細胞性肝癌組織芯片及免疫組化，檢測肝細胞性肝癌組織中ADAMTS5、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、CD34的表達。
　　2、采用McNemar檢驗比較ADAMTS5在肝細胞性肝癌癌組織及癌周正常組織的表達差異。
　　3、采用卡方檢驗或Fisher精確概率檢驗比較ADAMTS5的表達與臨床病理因

5、素之間的相關(guān)性。
　　4、采用Spearman等級相關(guān)系數(shù)比較ADAMTS5、VEGF、微血管密度（MVD）和腫瘤體積的相關(guān)性。
　　5、采用生存分析比較ADAMTS5的表達與患者總生存時間的關(guān)系。
　　6、采用Western Blot檢測ADAMTS5在正常肝細胞系與不同HCC細胞系中的表達。
　　第二部分、ADAMTS5在血管形成中的作用及其機制
　　1、通過構(gòu)建高表達 ADAMTS5的肝細胞性肝癌細胞

6、系及酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA），確定肝細胞性肝癌中ADAMTS5的表達對VEGF分泌的影響。
　　2、通過 HUVEC細胞遷移和管狀形成實驗，檢測肝細胞性肝癌細胞條件培養(yǎng)基對HUVEC細胞遷移和管狀形成的影響。
　　3、通過移植物成瘤實驗，進一步在體內(nèi)確定ADAMTS5對肝細胞性肝癌腫瘤生長及血管生成的影響。
　　第三部分、ADAMTS5單核苷酸多態(tài)性與中國漢族人群肝細胞癌易感性的研究
　　1、收集220例

7、肝細胞性肝癌患者和220例非肝細胞性肝癌對照患者臨床資料，并進行隨訪。
　　2、經(jīng)知情同意，提取患者外周血DNA，針對rs2830585單核苷酸多態(tài)性位點進行進行基因測序。
　　3、使用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析。
　　結(jié)果：
　　第一部分、ADAMTS5在肝細胞性肝癌中的表達及其意義
　　1、ADAMTS5在肝細胞性肝癌癌組織中的表達顯著低于癌周正常肝組織(McNemar檢驗，p＜0.05)

8、
　　2、ADAMTS5的表達與腫瘤分期顯著相關(guān)（P＜0.01）。
　　3、肝細胞性肝癌組織中 ADAMTS5的表達與 MVD(r=-0.530，p＜0.001)、VEGF（r=-0.640，p＜0.001)及腫瘤體積(r=-0.361，p＜0.05)顯著負相關(guān)。
　　4、ADAMTS5陽性表達肝細胞性肝癌患者總生存時間顯著優(yōu)于陰性表達ADAMTS5患者(29.56 versus12.96，p＜0.001)，ADAMT

9、S5可作為獨立的預后因子預測肝細胞性肝癌患者的總生存時間(p＜0.05)。
　　5、ADAMTS5在正常肝細胞系L02中的表達高于肝細胞性肝癌細胞系。
　　第二部分、ADAMTS5在血管形成中的作用及其機制
　　1、高表達ADAMTS5肝細胞性肝癌細胞條件培養(yǎng)基中VEGF的表達顯著低于其對照組細胞條件培養(yǎng)基（p＜0.001）。
　　2、與對照組細胞條件培養(yǎng)基相比較，高表達ADAMTS5肝細胞性肝癌細胞條件培養(yǎng)基可

10、顯著抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）遷移和管狀形成能力(p＜0.01)，并且人重組VEGF可以從很大程度上恢復HUVEC細胞被抑制的遷移和管狀形成能力(p＜0.01)。
　　3、高表達ADAMTS5肝細胞性肝癌細胞裸鼠移植瘤生長受到顯著抑制(p＜0.01)，免疫組化結(jié)果顯示ADAMTS5在裸鼠移植瘤中的高表達抑制了腫瘤內(nèi)的血管形成和VEGF表達。
　　第三部分、ADAMTS5單核苷酸多態(tài)性與中國漢族人群肝細胞癌易感性的研究

11、
　　1、Logistic回歸分析結(jié)果顯示，與rs2830585 G等位基因相比，A等位基因顯著降低肝細胞性肝癌發(fā)生風險（adjusted OR,0.348;95％CI0.236-0.512; P<0.001）；攜帶rs2830585 GA基因型的個體發(fā)生肝細胞性肝癌風險顯著低于GG基因型攜帶者（adjusted OR,0.339;95％CI,0.044-11.535;P＜0.001）。
　　2、分層分析結(jié)果顯示，rs283

12、0585基因型與分層因素之間不存在顯著交互作用。
　　3、相關(guān)性分析結(jié)果顯示，rs2830585基因型與肝細胞性肝癌臨床病理因素間不存在顯著相關(guān)性。
　　結(jié)論：
　　1、ADAMTS5在肝細胞性肝癌中表達下調(diào)，其高表達與肝細胞性肝癌患者的良好預后相關(guān)。
　　2、ADAMTS5通過減少肝細胞性肝癌中VEGF的分泌，抑制腫瘤血管生成及生長。
　　3、ADAMTS5 rs2830585與肝細胞性肝癌的易感性顯著相