KCTD11在肝細(xì)胞性肝癌中的表達(dá)及作用機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　原發(fā)性肝癌2015年的發(fā)病率處于所有癌癥第六位，病死率高居第四位。經(jīng)過(guò)數(shù)十年的努力，我國(guó)的原發(fā)性肝癌患者死亡率已有所下降。然而，肝癌患者人數(shù)仍然眾多，有必要繼續(xù)提高我國(guó)的肝癌診治技術(shù)。肝細(xì)胞性肝癌占到了原發(fā)性肝癌中的最大部分，目前肝細(xì)胞性肝癌的主要治療方式是以手術(shù)為主的綜合治療，但是目前效果仍然不夠理想。近年來(lái)興起的分子靶向治療推動(dòng)了包括乳腺癌和肺癌在內(nèi)的一些惡性腫瘤治療的進(jìn)步，然而目前肝細(xì)胞性肝癌的分子靶向治療仍沒(méi)有

2、太大進(jìn)展。因此，針對(duì)肝細(xì)胞性肝癌的分子病理特征和治療靶點(diǎn)的研究至關(guān)重要。KCTD11在人類(lèi)成神經(jīng)管細(xì)胞瘤中發(fā)揮著抑癌功能，目前還缺少針對(duì)KCTD11在肝細(xì)胞性肝癌中功能與機(jī)制的研究。
　　目的:
　　本研究通過(guò)研究KCTD11在肝細(xì)胞性肝癌與癌旁組織中的表達(dá)差異，分析KCTD11的差異表達(dá)與肝癌患者一系列臨床病理特征之間的相關(guān)性，并分析KCTD11表達(dá)在患者長(zhǎng)期預(yù)后判斷中的作用，從而驗(yàn)證KCTD11在肝細(xì)胞性肝癌中作為腫瘤分

3、子標(biāo)記物的潛在價(jià)值。本研究還通過(guò)一系列細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)探索KCTD11在肝細(xì)胞性肝癌中的作用，并通過(guò)表達(dá)譜芯片分析潛在的受KCTD11調(diào)控的基因、信號(hào)通路與生物學(xué)過(guò)程，從而明確KCTD11在肝細(xì)胞性肝癌形成與發(fā)展中的功能與相應(yīng)機(jī)制。
　　方法:
　　1.通過(guò)RT-PCR檢測(cè)KCTD11在肝細(xì)胞性肝癌的病理組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織中mRNA表達(dá)水平，采用免疫組化檢測(cè)這些標(biāo)本中KCTD11蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，比較這兩種組織中K

4、CTD11的表達(dá)差異。
　　2.取其中20例肝細(xì)胞性肝癌組織以及對(duì)應(yīng)的癌旁組織，檢測(cè)其中KCTD11所在染色體位置中雜合性缺失的發(fā)生情況。
　　3.分析51例HCC組織中KCTD11蛋白表達(dá)水平與患者臨床病理特征以及長(zhǎng)期預(yù)后之間的相關(guān)性。
　　4.檢測(cè)KCTD11在肝癌細(xì)胞株以及肝臟正常細(xì)胞株QSG-7701中的mRNA以及蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
　　5.分別在HCCLM3和Huh7細(xì)胞株中構(gòu)建KCTD11外源性過(guò)表達(dá)

5、和干擾的慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，通過(guò)體外的CCK-8實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、EDU實(shí)驗(yàn)、周期實(shí)驗(yàn)以及體內(nèi)的動(dòng)物皮下成瘤實(shí)驗(yàn)，來(lái)研究KCTD11在HCC細(xì)胞體外增殖與體內(nèi)成瘤中的功能，通過(guò)western blot探索KCTD11影響HCC細(xì)胞增殖的機(jī)制。
　　6.通過(guò)表達(dá)譜芯片檢測(cè)以及后續(xù)的Gene Ontology(GO)分析，探索受KCTD11調(diào)控的基因、信號(hào)通路與生物學(xué)進(jìn)程。通過(guò)細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)和免疫共沉淀等方法研究KCTD11調(diào)控HC

6、C細(xì)胞黏附的功能與機(jī)制。
　　7.通過(guò)侵襲實(shí)驗(yàn)、遷移實(shí)驗(yàn)和肝臟原位成瘤實(shí)驗(yàn)肺轉(zhuǎn)移模型的構(gòu)建來(lái)研究KCTD11對(duì)HCC遷移侵襲能力和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力的影響，并通過(guò)western blot探索其相應(yīng)機(jī)制。
　　8.通過(guò)western blot探索KCTD11在HCC中對(duì)Hippo通路的調(diào)控作用以及影響p21表達(dá)的多重機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1.在HCC組織中，KCTD11的mRNA表達(dá)與蛋白質(zhì)表達(dá)均低于癌旁組織。

7、　　2.KCTD11基因雜合性缺失是引起KCTD11在肝細(xì)胞性肝癌中的表達(dá)失調(diào)的主要原因之一。
　　3.HCC組織中KCTD11的不同表達(dá)水平與患者的腫瘤大小、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期等臨床病理指標(biāo)無(wú)顯著相關(guān)性。但是，KCTD11的低表達(dá)提示了肝癌患者的不良預(yù)后。
　　4.KCTD11在肝癌細(xì)胞株中的蛋白表達(dá)要低于正常肝細(xì)胞，并且在高侵襲性肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)要低于低侵襲性肝癌細(xì)胞株。
　　5.KCTD11通過(guò)促進(jìn)p21蛋白

8、的表達(dá)來(lái)抑制HCC細(xì)胞體外增殖與體內(nèi)成瘤。
　　6.KCTD11通過(guò)減少CTGF和CLDN1的表達(dá)來(lái)抑制HCC細(xì)胞黏附，CTGF與COL3A1之間存在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，在HCC中敲低CTGF的表達(dá)可促進(jìn)COL3A1的表達(dá)。
　　7.KCTD11通過(guò)調(diào)控MMP蛋白和EMT相關(guān)蛋白來(lái)抑制HCC遷移侵襲能力和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力;
　　8.KCTD11在HCC中可激活Hippo通路，并能通過(guò)穩(wěn)定p53蛋白表達(dá)或激活MST1