miR-183在肝癌細胞中的功能及人工miRNA簇表達載體的構(gòu)建研究.pdf

1、目的：(1)研究miR-183在肝細胞癌(HCC)中的重要作用。(2)構(gòu)建miR-34a及miR-424人工miRNA表達簇，分析表達簇對肝癌細胞周期進程的影響，并對miRNA的加工對攜帶miRNA宿主基因蛋白表達水平的影響進行初步研究。
　　 方法：(1)為研究miR-183在HCC中的重要作用，比較了HCC腫瘤組織和癌旁組織的miR-183表達，運用生物信息學技術(shù)預測了miR-183的候選靶基因，運用熒光素酶報告基因、wes

2、ternblot和qRT-PCR等技術(shù)對候選靶基因進行驗證，根據(jù)靶基因的功能特點深入分析miR-183在肝癌細胞中的作用。用DAPI細胞染色和Annexin-V分析肝癌細胞凋亡，DAPI 染色依據(jù)細胞核形態(tài)變化判斷細胞凋亡。
　　 (2) 從miRNA表達庫中擴增miR-34a 及miR-424的前體序列，將上述兩種miRNA串聯(lián)，構(gòu)建PGL-34a-424 人工miRNA簇表達載體。通過RT-PCR的方法檢測人工miRNA簇的

3、表達情況。然后將miRNA前體突變，運用熒光素酶報告基因技術(shù)研究miRNA的加工對攜帶miRNA宿主基因蛋白表達的影響。此外我們構(gòu)建了pEGFP-34a-424表達載體，分析人工miRNA簇對肝癌細胞的周期阻滯情況。
　　 結(jié)果：(1) qRT-PCR 方法檢測多組HCC 腫瘤組織及其癌旁組織中miR-183的表達，結(jié)果顯示68％的腫瘤組織中miR-183的表達顯著上調(diào)（2～300 倍）。運用TargetScan 生物信息學工具

4、預測miR-183 潛在的靶基因，熒光素酶報告基因技術(shù)證實PDCD4是miR-183直接作用的靶，western blot和qRT-PCR結(jié)果表明miR-183能夠下調(diào)PDCD4的mRNA及蛋白水平的表達。PDCD4 是TGF-β1 誘導的肝癌細胞凋亡通路上的重要分子，在HCC 中表達下調(diào)，DAPI細胞染色和Annexin-V分析均顯示轉(zhuǎn)染miR-183 后TGF-β1 誘導的肝癌細胞凋亡數(shù)顯著減少。(2) 成功構(gòu)建人工miRNA簇表達

5、載體，串聯(lián)的miR-34a和miR-424 均可獲得表達。熒光素酶實驗結(jié)果表明miRNA的加工對攜帶miRNA宿主基因蛋白的表達有顯著的影響。此外轉(zhuǎn)染人工miRNA簇pEGFP-34a-424的肝癌細胞G0/G1的細胞數(shù)目(90.15％)較pEGFP-34a (84.44％)和pEGFP-424(85.84％)增多。
　　 結(jié)論：(1) miR-183在多數(shù)HCC 組織中表達上調(diào)，miR-183 通過下調(diào)抑癌基因PDCD4的表達