miR-183在肝癌細(xì)胞中的功能及人工miRNA簇表達(dá)載體的構(gòu)建研究.pdf

1、目的：(1)研究miR-183在肝細(xì)胞癌(HCC)中的重要作用。(2)構(gòu)建miR-34a及miR-424人工miRNA表達(dá)簇，分析表達(dá)簇對肝癌細(xì)胞周期進(jìn)程的影響，并對miRNA的加工對攜帶miRNA宿主基因蛋白表達(dá)水平的影響進(jìn)行初步研究。
　　 方法：(1)為研究miR-183在HCC中的重要作用，比較了HCC腫瘤組織和癌旁組織的miR-183表達(dá)，運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測了miR-183的候選靶基因，運(yùn)用熒光素酶報(bào)告基因、wes

2、ternblot和qRT-PCR等技術(shù)對候選靶基因進(jìn)行驗(yàn)證，根據(jù)靶基因的功能特點(diǎn)深入分析miR-183在肝癌細(xì)胞中的作用。用DAPI細(xì)胞染色和Annexin-V分析肝癌細(xì)胞凋亡，DAPI 染色依據(jù)細(xì)胞核形態(tài)變化判斷細(xì)胞凋亡。
　　 (2) 從miRNA表達(dá)庫中擴(kuò)增miR-34a 及miR-424的前體序列，將上述兩種miRNA串聯(lián)，構(gòu)建PGL-34a-424 人工miRNA簇表達(dá)載體。通過RT-PCR的方法檢測人工miRNA簇的

3、表達(dá)情況。然后將miRNA前體突變，運(yùn)用熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)研究miRNA的加工對攜帶miRNA宿主基因蛋白表達(dá)的影響。此外我們構(gòu)建了pEGFP-34a-424表達(dá)載體，分析人工miRNA簇對肝癌細(xì)胞的周期阻滯情況。
　　 結(jié)果：(1) qRT-PCR 方法檢測多組HCC 腫瘤組織及其癌旁組織中miR-183的表達(dá)，結(jié)果顯示68％的腫瘤組織中miR-183的表達(dá)顯著上調(diào)（2～300 倍）。運(yùn)用TargetScan 生物信息學(xué)工具

4、預(yù)測miR-183 潛在的靶基因，熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)證實(shí)PDCD4是miR-183直接作用的靶，western blot和qRT-PCR結(jié)果表明miR-183能夠下調(diào)PDCD4的mRNA及蛋白水平的表達(dá)。PDCD4 是TGF-β1 誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡通路上的重要分子，在HCC 中表達(dá)下調(diào)，DAPI細(xì)胞染色和Annexin-V分析均顯示轉(zhuǎn)染miR-183 后TGF-β1 誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡數(shù)顯著減少。(2) 成功構(gòu)建人工miRNA簇表達(dá)

5、載體，串聯(lián)的miR-34a和miR-424 均可獲得表達(dá)。熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miRNA的加工對攜帶miRNA宿主基因蛋白的表達(dá)有顯著的影響。此外轉(zhuǎn)染人工miRNA簇pEGFP-34a-424的肝癌細(xì)胞G0/G1的細(xì)胞數(shù)目(90.15％)較pEGFP-34a (84.44％)和pEGFP-424(85.84％)增多。
　　 結(jié)論：(1) miR-183在多數(shù)HCC 組織中表達(dá)上調(diào)，miR-183 通過下調(diào)抑癌基因PDCD4的表達(dá)