PKM2對谷氨酰胺代謝和線粒體損傷的調(diào)控機制及白藜蘆醇的干預(yù)作用.pdf

1、為應(yīng)對缺氧和低營養(yǎng)條件的腫瘤微環(huán)境，腫瘤細胞往往發(fā)生能量代謝的改變，即“代謝重編程”。主要表現(xiàn)在兩個方面:有氧糖酵解和對谷氨酰胺的高度依賴。腫瘤細胞通過代謝重塑為其生物合成提供大量的中間代謝產(chǎn)物，表明代謝重編程在腫瘤惡性轉(zhuǎn)化過程中舉足輕重的作用。腫瘤細胞的葡萄糖代謝和谷氨酰胺代謝途徑均受到復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控，因此探討這兩種代謝途徑間的調(diào)控關(guān)系及其產(chǎn)生原因，將為以腫瘤代謝為靶點的腫瘤治療提供理論基礎(chǔ)。
　　近年來，隨著人們對腫

2、瘤細胞能量代謝重塑的深入研究，發(fā)現(xiàn)M2型丙酮酸激酶(M2type pyruvate kinase，PKM2)在糖酵解過程中扮演著關(guān)鍵角色。PKM2是糖酵解途徑中將磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)轉(zhuǎn)化成為丙酮酸和ATP的限速酶。已知PKM2在腫瘤細胞中特異性高表達，在協(xié)調(diào)腫瘤細胞葡萄糖相關(guān)代謝途徑（包括糖酵解、磷酸戊糖和絲氨酸合成途徑）中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但PKM2是否參與谷氨酰胺代謝及線粒體功能調(diào)控卻鮮為人知。
　　本研究探討了PKM2與谷

3、氨酰胺代謝及線粒體功能調(diào)控之間的關(guān)系，并對其分子機制進行深入研究，為以代謝為靶點的腫瘤治療提供新思路;進一步以PKM2作為腫瘤治療的靶點，探討了白藜蘆醇對PKM2的干預(yù)作用及分子機制，同時拓展了白藜蘆醇的藥用價值。本研究獲得的主要研究結(jié)果如下:
　　(1)探討PKM2與谷氨酰胺代謝之間的關(guān)系及其分子機制。研究結(jié)果表明，PKM2穩(wěn)定敲低能夠增加谷氨酰胺酶Gls1、Gls2，谷氨酰胺轉(zhuǎn)運受體SLC1A5及其上游轉(zhuǎn)錄因子β-cateni

4、n、c-Myc的表達，而PKM2過表達可抑制其表達，表明β-catenin/c-Myc信號通路介導(dǎo)PKM2對谷氨酰胺代謝的調(diào)控。放線菌素D實驗顯示，PKM2上調(diào)β-catenin的表達主要是通過調(diào)控其轉(zhuǎn)錄水平，而不是通過抑制mRNA降解。檢測PKM2不同點突變細胞株中β-catenin的表達，發(fā)現(xiàn)R399E突變細胞能明顯抑制β-catenin的表達，即二聚體形式的PKM2發(fā)揮關(guān)鍵作用。PKM2過表達上調(diào)miR-200a的表達，miR-2

5、00a可與β-catenin的3'UTR結(jié)合抑制β-catenin的表達。
　　(2)探討PKM2與線粒體功能之間的關(guān)系。采用線粒體探針標記PKM2過表達及敲低的細胞中的線粒體，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)PKM2過表達的細胞中線粒體圍繞細胞核分布，融合線粒體的比例升高，線粒體數(shù)量減少。而PKM2敲低后，線粒體分裂為更小的單位，數(shù)量增多。qPCR和western blot結(jié)果顯示PKM2過表達后，線粒體分裂蛋白Drp1表達減少，融合蛋白Mfn2

6、表達升高;PKM2敲低后，Drp1表達升高，Mfn2表達降低;同時，PKM2過表達導(dǎo)致ATP生成量減少，線粒體DNA拷貝數(shù)增加，電子傳遞鏈復(fù)合物的表達下降。
　　(3)探討PKM2通過Drp1調(diào)控線粒體動態(tài)平衡的分子機制。研究結(jié)果顯示PKM2過表達能夠在蛋白水平抑制p53表達，PKM2敲低促進其表達，而對p53mRNA水平?jīng)]有影響。采用p53siRNA處理細胞后，Drp1隨p53表達的下降而下降，表明PKM2能夠通過p53調(diào)控Dr

7、p1的表達。蛋白穩(wěn)定性實驗提示，PKM2過表達促進了p53通過蛋白酶體途徑降解，而PKM2敲低可增加p53蛋白的穩(wěn)定性，該過程是通過MDM2介導(dǎo)的p53泛素化實現(xiàn)的。免疫共沉淀及GST pull-down實驗表明，PKM2與p53、MDM2存在相互作用，推測PKM2與MDM2可結(jié)合到p53不同的結(jié)構(gòu)域形成三元復(fù)合物促進p53的泛素化，進而通過蛋白酶體途徑被降解。免疫組化檢測宮頸癌病人臨床樣本中PKM2和Drp1的表達，結(jié)果顯示PKM2與

8、Drp1的表達呈負相關(guān)，這與細胞水平得到的結(jié)果是一致的。
　　(4)探討PKM2通過Mfn2調(diào)控線粒體動態(tài)平衡的分子機制。研究表明PKM2過表達能夠抑制miR-106b的表達。雙熒光素酶報告實驗顯示miR-106b可以直接靶向Mfn23'UTR，進而抑制Mfn2的表達。采用miR-106b模擬物轉(zhuǎn)染細胞后，發(fā)現(xiàn)Mfn2的表達水平顯著降低，融合線粒體的數(shù)量及mtDNA拷貝數(shù)減少，ATP生成量升高。免疫組化檢測乳腺癌病人臨床樣本中PK

9、M2和Mfn2的表達，結(jié)果顯示PKM2與Mfn2的表達呈正相關(guān)，這與細胞中所得結(jié)果是一致的。
　　(5)探討白藜蘆醇對PKM2的干預(yù)作用及分子機制。研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠通過靶向抑制PKM2的表達發(fā)揮其抗腫瘤活性。白藜蘆醇處理后導(dǎo)致線粒體分裂成更小、更多的線粒體，且Drp1和Fis表達明顯升高，Mfn2的表達顯著下降，PKM2過表達可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象;另外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)鍵分子GRP78、CHOP和Caspase12顯著上升，PKM2過

10、表達后其表達明顯逆轉(zhuǎn)。檢測PKM2敲低的穩(wěn)定細胞株中上述指標的表達，發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標及線粒體分裂蛋白表達上調(diào)，線粒體融合蛋白表達下降。以上結(jié)果表明PKM2介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體分裂參與白藜蘆醇誘導(dǎo)的細胞凋亡。雙熒光素酶報告實驗顯示miR-326可直接與PKM2的3'UTR結(jié)合，進一步實驗結(jié)果表明白藜蘆醇能夠通過上調(diào)miR-326有效抑制PKM2的表達。
　　綜上所述:PKM2缺失可通過激活β-catenin/c-Myc信號通路