白藜蘆醇抗心肌缺血再灌注損傷的線粒體機制研究.pdf

1、白藜蘆醇是一種生物活性多樣的多酚類化合物，主要存在于葡萄、花生、虎杖等食品和藥材中。白藜蘆醇具有良好的心血管保護、抗衰老、抗腫瘤等營養(yǎng)保健作用，是分子營養(yǎng)學和藥理學熱門研究對象之一。近年來國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有顯著的抗心肌缺血再灌注損傷保護作用，但其作用機制尚不明確。線粒體為心肌中含量最豐富的細胞器，白藜蘆醇對心肌損傷的保護作用，很有可能與線粒體相關。線粒體不僅為心肌提供能量，而且在維持細胞的Ca2+穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)細胞凋亡或壞死等過程中

2、起著決定性作用，其功能障礙與線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔道(mitochondria permeability transition pore，mPTP)密切相關。mPTP的開放是缺血再灌注損傷從可逆向不可逆過渡的一個關鍵因素。其中位于mPTP外膜上的電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion channel，VDAC)控制著離子和代謝物的轉(zhuǎn)運，對于mPTP的開放和關閉起重要作用。故我們推測VDAC可能是白藜蘆醇的抗心肌

3、缺血再灌注保護作用的線粒體靶點。
　　 本課題采用H9c2心肌細胞株，利用基因克隆和RNA干擾(RNAi)技術，通過體外缺血再灌注損傷模型，即缺氧/復氧(A/R)損傷模型，測定在VDAC1蛋白正常表達、低表達和高表達，以及細胞外液無Cl-等不同情況下，白藜蘆醇對心肌細胞、線粒體功能及線粒體介導的凋亡通路的作用。利用流式細胞儀測定細胞內(nèi)或線粒體內(nèi)Ca2+、活性氧(ROS)深度變化，熒光分光光度計檢測Cl-濃度的變化，以進一步闡明白

4、藜蘆醇對急性心肌損傷保護的分子生物學機制?，F(xiàn)將本論文主要研究結果歸納如下：
　　 1.探討了白藜蘆醇對H9c2心肌細胞A/R損傷保護作用的量效關系。MTT法檢測細胞存活率；按試劑盒說明測定細胞內(nèi)LDH和CPK的活性、MDA含量以及抗氧化物酶SOD和GSH-Px的活性；流式細胞法檢測心肌細胞內(nèi)Ca2+濃度、ROS、線粒體膜電位及細胞凋亡；分光光度計法測定mPTP的開放。結果發(fā)現(xiàn)50μM的白藜蘆醇可發(fā)揮最佳心肌保護作用，降低LDH和

5、CPK活性，提高心肌細胞存活率，提高抗氧化酶SOD和GSH-Px活性，減少ROS生成和MDA含量，防止鈣超載和mPTP開放，維護線粒體膜電位，減少細胞凋亡。
　　 2.Western blot法檢測白藜蘆醇及A/R損傷對VDAC1表達的影響。結果發(fā)現(xiàn)A/R損傷可上調(diào)VDAC1的表達，而白藜蘆醇則可抑制VDAC1的表達。
　　 3.通過RNAi技術進一步明確VDAC1在A/R損傷導致mPTP開放中的意義。結果表明，RNAi

6、特異性沉默VDAC1后可顯著減輕A/R后的氧化應激、鈣超載、維護線粒體膜電位，防止mPTP開放，從而抑制細胞色素c(Cyt c)的釋放和caspase-3的激活，減少細胞凋亡。說明VDAC1在A/R損傷引起mPTP開放及線粒體凋亡通路激活中發(fā)揮著重要的作用。
　　 4.構建VDAC1真核表達載體pFLAG-VDAC1，采用基因轉(zhuǎn)導技術建立VDAC1蛋白高表達組，通過反向驗證進一步明確白藜蘆醇心肌保護作用與VDAC1的關系。結果表

7、明導入pFLAG-VDAC1后可取消白藜蘆醇的心肌保護作用，說明白藜蘆醇的心肌保護作用就是由VDAC1介導的。
　　 5.深入探討VDAC1參與mPTP開放的調(diào)節(jié)機制。通過流式細胞儀檢測線粒體內(nèi)Cl-濃度發(fā)現(xiàn)，A/R損傷時線粒體內(nèi)Cl-濃度明顯升高，而利用RNAi下調(diào)VDAC1水平則可減少線粒體內(nèi)Cl-濃度，并且白藜蘆醇預處理或去除細胞外Cl-也可有效降低線粒體內(nèi)Cl-濃度，導致Ca2+濃度下降，ROS生成減少，防止mPTP開放

8、。此結果說明VDAC1就是Cl-進出線粒體的主要通道，并且Cl-在mPTP開放調(diào)節(jié)和VDAC介導的白藜蘆醇抗急性心肌保護作用及線粒體功能維護中發(fā)揮著重要的作用。
　　 上述結果表明：白藜蘆醇通過抑制A/R損傷時VDAC1的表達，減少Cl-進入線粒體，取消”氯增加誘發(fā)鈣小體釋放機制”的觸發(fā)作用，從而減輕Ca2+超載和氧化應激，防止mPTP開放，維持線粒體膜電位，抑制Cyt c的釋放及caspase-3的活性，最終顯著減少細胞凋亡。