PAK4通過上調(diào)突變型p53蛋白的表達(dá)降低乳腺癌對多柔比星的敏感性.pdf

1、背景與目的：乳腺癌是女性最常見的腫瘤之一，也是女性癌癥患者的第二大死因，其發(fā)病率逐年增高，且日益年輕化，已成為中國婦女疾病負(fù)擔(dān)最重的惡性腫瘤之一?；熢谌橄侔┚C合治療中的占據(jù)著重要的地位，其中蒽環(huán)類藥物作為乳腺癌的一線化療方案選擇藥物，在臨床治療上得到廣泛應(yīng)用。但是不同的患者對其敏感性有顯著地個(gè)體差異，不同患者的療效不甚相同，甚至有一部分患者產(chǎn)生耐藥，它們并不能從蒽環(huán)類化療方案中明顯獲益。近年來，隨著腫瘤分子生物學(xué)和對基因功能的深入研究

2、，人們逐漸認(rèn)識到，暴露于化療制劑后決定腫瘤細(xì)胞命運(yùn)的主要是基因型而不是制劑的基因毒性，腫瘤細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)水平是造成對同一化療藥物敏感性不同的主要原因[1]。因此，探尋乳腺癌化療的療效預(yù)測因子，明確其耐藥機(jī)制可能成為解決乳腺癌化療耐藥問題的關(guān)鍵。近來大量研究表明p21-活化激酶4（p21-activated kinase4,PAK4）過表達(dá)于人類多種腫瘤組織中[2]，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[3]。而且越來越多的文獻(xiàn)報(bào)道，P

3、AK4與化療耐藥有顯著的相關(guān)性[4]。PAK4可以降低腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性[5]，但具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步完善。p53是腫瘤抑制基因，但約50％的腫瘤會發(fā)生 p53突變[6]。突變型 P53（mutant-type P53,mtP53）不僅能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]，而且與腫瘤對化療的敏感性有密切的關(guān)系[8]。有研究報(bào)道，在多柔比星等細(xì)胞毒性藥物引起的細(xì)胞死亡中，P53起著關(guān)鍵作用[9]。存在mtP53的細(xì)胞比存在野生型P53(wi

4、ld-type P53,wtP53)更容易產(chǎn)生對包括蒽環(huán)類在內(nèi)的多藥耐藥[10]。P53突變是細(xì)胞株對致細(xì)胞DNA損傷藥物產(chǎn)生耐藥的最主要原因[11]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞系中，PAK4蛋白的表達(dá)與P53一致。在乳腺癌中，PAK4與mtP53是否存在調(diào)控關(guān)系，目前的研究尚不清楚，相關(guān)研究有待進(jìn)一步完善。明確 PAK4與mtP53的關(guān)系，可能能夠?yàn)槿橄侔┑闹委?，特別是逆轉(zhuǎn)化療耐藥，提供一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。
　　材料和方法：

5、本實(shí)驗(yàn)通過在MDA-MB-231細(xì)胞中建立過表達(dá)和干擾PAK4的細(xì)胞株，采用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)來研究PAK4對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響；采用藥物敏感性實(shí)驗(yàn)來研究PAK4對乳腺癌細(xì)胞化療敏感性的影響；采用Western Blot及實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)一步探索PAK4影響乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的機(jī)制；利用免疫組織化學(xué)方法檢測乳腺癌組織中PAK4與mtP53的表達(dá)情況。應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用卡方檢驗(yàn)分析PAK4與mtP53表達(dá)在乳

6、腺癌中的相關(guān)性。P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)PAK4后，MDA-MB-231細(xì)胞的增殖能力明顯上升；而干擾PAK4后乳腺癌細(xì)胞增殖能力明顯下降。
　　2.藥物敏感性實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)PAK4后，MDA-MB-231細(xì)胞對多柔比星的敏感性明顯降低；而干擾PAK4后，MDA-MB-231細(xì)胞對多柔比星的敏感性明顯升高。
　　3.Western Bl

7、ot結(jié)果顯示，過表達(dá)PAK4后，p-ATM（Ser1981）、p-Chk2(Thr68)、p-P53(Ser15)及 mtP53蛋白含量增加；干擾 PAK4后， p-ATM（Ser1981）、p-Chk2(Thr68)、p-P53(Ser15)及mtP53蛋白含量降低。而總ATM蛋白含量一直不變。
　　4. RT-PCR結(jié)果顯示，無論是上調(diào)還是下調(diào)PAK4mRNA水平后，mtP53在mRNA水平均無明顯變化。
　　5. PA