NGF對表達突變型APP的PC12細胞作用機理的實驗研究.pdf

1、目的： 阿爾茨海默病(AD)是常見的老年人慢性退行性神經(jīng)疾病，AD的主要病理學標志包括老年斑(SP)和神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFTs)。SP的淀粉樣沉積物主要成份是β-淀粉樣肽(Aβ-包括Aβ<,40>和Aβ<,42>)，由淀粉樣前體蛋白(APP)分解而來，被認為在AD的發(fā)病中起著十分重要的作用。目前許多證據(jù)表明，APP基因的點突變、代謝異常及過表達所引起的Aβ聚集，是AD發(fā)病的重要原因之一。越來越多的研究證實AD存在多基因缺陷，包括

2、APP、PS1、PS2、apoE4、ACT以及ERAB基因，且建立了許多AD轉(zhuǎn)基因動物模型。然而，受不同內(nèi)外環(huán)境的影響及不同的實驗條件限制，不便于系統(tǒng)探討AD特征性標志產(chǎn)物APP及Aβ的表達及其對細胞的影響。目前，國外對AD病的致病機制的研究主要集中在轉(zhuǎn)基因動物模型上，國內(nèi)尚無通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立轉(zhuǎn)基因AD細胞模型并使用NGF進行干預的報道。本研究旨在構(gòu)建突變型APP基因序列的質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染PC12細胞，觀察APP及Aβ的表達、細胞形態(tài)及細胞

3、周期的改變，并使用神經(jīng)生長因子(NGF)進行干預，系統(tǒng)探討AD重要致病因素APP及Aβ表達的分子機制及NGF對AD的治療作用。 方法： 1.質(zhì)粒構(gòu)建：NCBI網(wǎng)站上查找APP基因及其啟動子的序列，分析其區(qū)域，設(shè)計引物，以人胎腦組織cDNA作模板擴增APP序列，同時采用over-lap PCR方法擴增突變型APP基因，將突變型APP基因與綠色熒光蛋白基因(GFP)融合后構(gòu)建成真核表達載體Tmu-APP-GFP，并測序證實。

4、 2．PCI2細胞轉(zhuǎn)染Tmu-APP-GFP真核表達載體后，APP及Aβ的表達以及細胞形態(tài)及細胞周期的變化：將Tmu-APP-GFP質(zhì)粒DNA進行大量抽提并進行PC12細胞轉(zhuǎn)染，RT-PCR檢測細胞中mRNA的表達，并在轉(zhuǎn)染24h、48h、72h三個時間點進行Ap的放免測定，流式細胞儀檢測細胞周期。 3．NGF對PCI2細胞作用研究：將PCI2細胞按轉(zhuǎn)染和非轉(zhuǎn)染，加用與不加用NGF培養(yǎng)液以及加用NGF培養(yǎng)液的先后順序分為

5、NGF／APP組、APP組、APP／NGF組、NGF組以及PCI2組共5組。分別進行RT-PCR檢測PCI2細胞中APP mRNA表達、Ap的放免測定及流式細胞儀檢測細胞周期。 結(jié)果： 1．突變型APP基因和GFP基因融合后的真核表達載體經(jīng)酶切檢測及測序分析證實構(gòu)建成功。 2．經(jīng)RT-PCR檢測，轉(zhuǎn)染后PCI2細胞．APP產(chǎn)量明顯高于未轉(zhuǎn)染的細胞；經(jīng)放免測定的Ap含量在24h、48h、72h三個時間點，轉(zhuǎn)染組

6、較非轉(zhuǎn)染組均有明顯的提高；經(jīng)流式細胞儀檢測，轉(zhuǎn)染組較非轉(zhuǎn)染組處于Go期的細胞明顯增多，而進入S期的細胞減少，增值指數(shù)(PI)明顯降低。 3．經(jīng)RT-PCR檢測，5組中轉(zhuǎn)染突變型．APP質(zhì)粒的NGF／APP、APP、APP／NGF組細胞中APP產(chǎn)量明顯高于NGF和PCI2組；經(jīng)放免測定的Aβ含量在24h、48h、72h三個時問點，NGF／APP、NGF、PCI2組較APP、APP／NGF組明顯減少，有顯著差異性；經(jīng)流式細胞儀檢測，

7、與正常對照PCI2組相比,NGF／APP組細胞在Go期明顯增多，而進入S期的減少；但相比APP組，NGF／APP組細胞在Go期的明顯減少，而進入S期的細胞增多。PI值在NGF／APP組與NGF、PCI2組之間有極顯著差異，與APP組和APP／NGF組也有顯著差異。 結(jié)論： 1、突變型．AD細胞模型是用于APP異常代謝途徑，AD發(fā)病分子和細胞水平機制，藥物篩選及藥物的作用機制研究的重要工具。 2、APP基因突變是導