腦缺血誘導的脾臟巨噬細胞極性變化及機制的研究.pdf

1、本文從以下幾方面進行論述：
　　第一部分 腦缺血大鼠脾臟巨噬細胞極性的動態(tài)變化
　　卒中相關(guān)免疫抑制(stroke associated immunodepression，SAI)增加卒中患者感染的發(fā)生，可增加患者死亡率，預后不良。研究表明腦缺血早期，機體就存在脾臟萎縮、脾臟細胞數(shù)量減少;單核細胞功能減退，淋巴細胞數(shù)目減少;腫瘤壞死因子-α(tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)和γ-干擾素(inter

2、feronγ，IFN-γ)等促進炎癥的細胞因子分泌減少，抗炎因子白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)水平升高，人類白細胞抗原-DR(human leukocyte antigen-DR，HLA-DR)表達下降等免疫抑制狀態(tài)。脾臟巨噬細胞在不同微環(huán)境下分化為不同的極性，主要分為M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞。M1型巨噬細胞主要促進炎癥，而M2型巨噬細胞主要起抗炎的作用，促進組織損傷的修復。動物研究發(fā)現(xiàn)，缺血腦組織處

3、存在M1型和M2型外源性巨噬細胞。腦缺血區(qū)M1型巨噬細胞加重腦損傷，M2型巨噬細胞主要起到組織修復的作用。在外周，M2型巨噬細胞主要起到免疫抑制作用。平衡外周免疫和腦部炎癥成為腦卒中治療及卒中后感染預防的關(guān)鍵點。因此，檢測大腦中動脈阻斷(middle cerebral artery occlusion，MCAO)后脾臟巨噬細胞極性變化情況，并探討其動態(tài)變化的規(guī)律，對進一步闡明卒中后免疫抑制的機制有重要意義。
　　目的:探討腦缺血大

4、鼠脾臟巨噬細胞極化的動態(tài)變化情況。
　　方法:應用成年雄性SD大鼠，建立MCAO模型。根據(jù)再灌注不同時間點，將實驗分為假手術(shù)組(sham operation group)，MCAO6h、12h、24h、48h、72h組。采用實時熒光定量PCR(quantitative Real time PCR，RT-qPCR)測定脾臟巨噬細胞iNOS，Arg-1，YM1及IL-10 mRNA的表達，評估脾臟巨噬細胞極性變化情況。
　　結(jié)果

5、:與假手術(shù)組相比，M1型巨噬細胞的標志物iNOS mRNA的表達在MCAO后6h稍有下降，MCAO12h時表達開始升高，MCAO24h表達至最高(P＜0.01)，之后緩慢下降，48h時仍高于假手術(shù)組(P＜0.01)，72h恢復至假手術(shù)組。M2型巨噬細胞的標志物Arg-1mRNA的表達在6h升至最高(P＜0.01)，隨后緩慢下降，24h降至最低點(P＜0.01)，后緩慢上升，48h時低于假手術(shù)組，72h稍高于假手術(shù)組，但有統(tǒng)計學差異(P＜

6、0.05)。M2a型巨噬細胞標志物YM1 mRNA的表達在各時間點沒有明顯差異，6h和12h點無明顯變化，隨后升高，48h時升至最高點，但無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。調(diào)節(jié)型巨噬細胞標志物IL-10 mRNA的表達在6h升至最高(P＜0.01)，隨后緩慢下降，24h降至最低點(P＜0.05)，后緩慢上升，48h時仍低于對照組，但無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，72h時高于假手術(shù)組，但無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:MCAO

7、大鼠早期即出現(xiàn)向M2調(diào)節(jié)型巨噬細胞極化，表明機體在腦缺血早期即存在免疫抑制狀態(tài)。
　　第二部分 腦缺血大鼠脾臟巨噬細胞極性的機制研究
　　研究表明，腦缺血后交感神經(jīng)系統(tǒng)(sympathetic nervous system，SNS)過度激活，兒茶酚胺分泌增加，作用于免疫細胞表面的β2腎上腺素受體(β2-adrenergic receptor,β2AR)，使得機體處于免疫抑制的狀態(tài)。兒茶酚胺可激活β2腎上腺素受體，通過磷脂酰肌

8、醇3激酶(phosphatidylinositol3 kinase， PI3K)/Akt信號通路增加向M2型巨噬細胞極化，增加巨噬細胞的吞噬活性，發(fā)揮抗炎效應。而與環(huán)腺苷酸/蛋白激酶A(cyclic adenosine monophosphate/protein kinases A,cAMP/PKA)信號通路無關(guān)。本研究主要探討:在腦缺血早期脾臟巨噬細胞向M2調(diào)節(jié)型巨噬細胞極化是否與腦缺血后交感神經(jīng)過度激活相關(guān)，并進一步探討巨噬細胞向M

9、2型調(diào)節(jié)型巨噬細胞極化的分子機制。
　　目的:探討腦缺血早期大鼠脾臟巨噬細胞向調(diào)節(jié)型巨噬細胞極化的分子機制。
　　方法:應用成年雄性SD大鼠，建立MCAO模型。為了探討巨噬細胞向M2型調(diào)節(jié)型巨噬細胞極化的機制，應用β受體阻斷劑普萘洛爾在MCAO造模前、造模后4h腹腔注射給藥，其對照組給予相同體積的生理鹽水，分別為MCAO+Pro組和MCAO+saline組，應用糖皮質(zhì)受體阻斷劑RU486在MCAO造模前12h及2h腹腔給藥，

10、其相應的對照組給予相同體積的乙醇/豆油，分別為MCAO+RU486組和MCAO+oil組。采用RT-qPCR測定脾臟巨噬細胞iNOS、Arg-1及IL-10mRNA的表達。應用Western-blot檢測脾臟巨噬細胞MHC-Ⅱ，p-Akt及p-PKA蛋白的表達。
　　結(jié)果:與MCAO+saline組相比，MCAO+Pro組iNOS mRNA的表達增高(P＜0.01)，Arg-1mRNA的表達下降(P＜0.01)，IL-10mRNA

11、的表達下降(P＜0.01);提示應用β受體阻斷劑后，巨噬細胞向M1型極化增加，向M2調(diào)節(jié)型巨噬細胞極化減少，即阻斷交感神經(jīng)后，機體向M2調(diào)節(jié)型巨噬細胞極化減少。與MCAO+oil組相比，MCAO+RU486組iNOS、Arg-1及IL-10mRNA的表達未有顯著差異(P＞0.05)，表明糖皮質(zhì)激素與腦缺血后脾臟巨噬細胞的極化不相關(guān)。與MCAO+saline組相比，MCAO+Pro組MHC-Ⅱ蛋白的表達增加(P＜0.01)，與MCAO+o

12、il組相比，MCAO+RU486組MHC-Ⅱ的蛋白表達未有顯著變化(P＞0.05)。與MCAO+saline組相比，MCAO+Pro組p-Akt蛋白表達減少(P＜0.01)，p-PKA蛋白的表達沒有顯著差異;與MCAO+oil組相比，MCAO+RU486組p-Akt蛋白和p-PKA蛋白的表達均無顯著差異，考慮交感神經(jīng)激活后致調(diào)節(jié)型巨噬細胞極化與PI3K/Akt信號通路相關(guān)。
　　結(jié)論:應用β受體阻斷劑普萘洛爾后，脾臟巨噬細胞iNO