細胞自噬對oxLDL誘導巨噬細胞焦亡(pyroptosis)的影響及機制.pdf

1、背景及目的:細胞焦亡是近期發(fā)現(xiàn)的一種新的細胞死亡方式,其生物學特征是依賴于半胱天冬氨酸蛋白酶-1(Cysteine aspartate-specific protease-1,caspase-1)的死亡方式并伴隨著炎癥反應的發(fā)生。最近的研究發(fā)現(xiàn)介導細胞焦亡的重要功能分子caspase-1與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
　　Caspase-1的重要功能之一是介導單核巨噬細胞等受到病原體感染或內(nèi)源性因素刺激后引起的細胞焦亡;同時,

2、把白細胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)前體裂解成具有活性的IL-1β,而后者等能募集、激活其他免疫細胞,誘導其它炎癥因子、趨化因子、粘附分子等的合成,它們級聯(lián)放大了炎癥反應,促進動脈粥樣硬化的發(fā)展。
　　自噬是真核細胞所共有的一種降解胞內(nèi)異?；蜻^多的細胞器、蛋白等來維持細胞正常功能的機制。自噬可利用其雙層的膜結(jié)構(gòu)將要降解的細胞器或蛋白等進行包裹,形成自噬體,自噬體隨后與溶酶體融合,將這些底物進行降解。缺乏自

3、噬會導致膽固醇晶體在斑塊中的聚集以及NACHT決定域,亮氨酸重復序列,pyrin決定域蛋白-3（NOD-,LRR-,and pyrin domain[PYD]-containing protein3,NLRP3)炎癥小體的活化,從而加重了動脈粥樣硬化的發(fā)展進程?；钚匝醮?reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生與細胞焦亡關(guān)系密切,可以活化caspase-1,引起細胞焦亡。自噬在炎癥體及caspase-1的活化中發(fā)揮

4、重要作用。
　　他汀類藥物是羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑,此類藥物表現(xiàn)出多效性,包括改善內(nèi)皮功能,促進斑塊的穩(wěn)定,減少氧化應激和炎癥,抑制血栓的形成。最近研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物可以提高某些組織細胞的自噬水平。但其對氧化的低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)誘導的巨噬細胞自噬、細胞焦亡的影響以及產(chǎn)生影響的可能途徑及相關(guān)機制目前尚不清楚。
　　本研究擬通過建

5、立oxLDL誘導巨噬細胞脂質(zhì)聚集的模型,觀察脂質(zhì)聚集的巨噬細胞在辛伐他汀作用后細胞自噬及焦亡發(fā)生情況及可能的作用機制,探討他汀類藥物在oxLDL誘導巨噬細胞脂質(zhì)聚集過程中的作用,為尋找藥物作用新途徑及提供新的臨床治療思路提供實驗依據(jù)。
　　方法:oxLDL作用于J774A.1小鼠巨噬細胞,采用油紅O染色法檢測細胞內(nèi)的脂質(zhì)聚集情況;細胞焦亡的檢測采用乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)釋放試劑盒檢測LDH

6、的釋放;熒光顯微鏡觀察丫啶橙(Acridine orange,AO)、溴化乙錠(Ethidium Bromide,EB)的染色情況;Western-blot檢測pro-caspase-1、cleaved caspase-1和IL-1β的表達情況;加入辛伐他汀藥物作用后,檢測上述實驗結(jié)果的變化情況;采用2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2',7'-dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)染色流式細胞儀檢測辛

7、伐他汀作用前后細胞內(nèi)ROS的水平;采用western-blot檢測辛伐他汀作用前后LC3-Ⅱ/Ⅰ、beclin-1的表達情況;激光共聚焦觀察LC3-GFP熒光聚集情況。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建了 oxLDL誘導脂質(zhì)聚集的巨噬細胞的模型;油紅 O染色結(jié)果表明,oxLDL作用于巨噬細胞后可導致脂質(zhì)聚集,并呈明顯的劑量依賴;OxLDL作用于巨噬細胞后,LDH的釋放顯著增加由(18.04±3.57)％增加到(62.4±7.32)%;AO EB

8、的復染中,橘紅色的熒光所占百分比顯著增加由(6±4)%增加到(65±3)%,提示細胞膜出現(xiàn)不完整的情況增多;Western-blot檢測caspase-1和IL-1β的表達呈增高的趨勢;加入辛伐他汀藥物作用后,油紅O染色結(jié)果表明脂質(zhì)聚集情況減少,總膽固醇檢測顯示細胞內(nèi)總膽固醇有減少的趨勢,細胞焦亡檢測結(jié)果:LDH釋放減少,AO EB染色結(jié)果顯示橘紅色的熒光有所占百分比減少趨勢,EB染色陽性(橘紅色)細胞減少至(35±7)%,wester

9、n-blot檢測活化 caspase-1和成熟 IL-1β的表達明顯降低。細胞自噬檢測結(jié)果:Western-blot結(jié)果顯示細胞內(nèi)LC3Ⅱ/Ⅰ的表達與單一加入oxLDL作用的巨噬細胞相比增加明顯;激光共聚焦顯微鏡結(jié)果也表明辛伐他汀可顯著增加GFP-LC3熒光聚集體的形成。DCFH-DA染色流式細胞儀檢測結(jié)果:oxLDL誘導巨噬細胞產(chǎn)生大量的ROS,在辛伐他汀作用后,細胞內(nèi)ROS水平顯著降低至(139±0.97)%,應用3-MA自噬抑制劑