自噬在大鼠脊髓損傷后神經源性膀胱不同時間點表達的機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個方面進行論述：
　　第一部分 自噬在大鼠脊髓損傷后神經源性膀胱不同時間點的表達
　　研究目的:建立大鼠脊髓損傷模型，觀察自噬在脊髓損傷后神經源性膀胱不同時間點膀胱逼尿肌中的表達。
　　研究方法:36只雄性Wistar大鼠隨機分為脊髓損傷組和假手術組。對照組只接受T10-T11水平的椎板切除術，而不損傷脊膜;實驗組大鼠采用改良的Allen's法進行脊髓損傷的手術。兩組均在術后1天、4天和14天進行運動評

2、分和膀胱功能評估。在每一個時間點，每組都隨機選出6只實驗動物被處死，取材。使用BBB功能評定量表評定大鼠的運動功能情況;使用膀胱殘余尿量和膀胱功能評分評估大鼠膀胱功能;Western blotting檢測大鼠膀胱組織中的LC3蛋白表達;應用免疫熒光法檢測自噬相關指標LC3、P62，觀察其陽性細胞表達;實時熒光定量RT-PCR對大鼠膀胱組織檢測自噬活動相關基因LC3、P62 mRNA水平。
　　研究結果:實驗發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷組大鼠術后

3、雙下肢功能喪失，并拖地行走，但是從術后1天開始，大鼠下肢功能逐漸恢復。脊髓損傷組大鼠術后膀胱功能出現(xiàn)障礙，但是隨著時間逐漸有所恢復。Western blot結果顯示，與假手術組相比，脊髓損傷組大鼠逼尿肌LC3-Ⅱ蛋白表達顯著增高(P＜0.01)，而且在術后4天達到最高值。免疫熒光染色結果顯示在術后1天、4天、14天，脊髓損傷組逼尿肌LC3-Ⅱ的表達較假手術組明顯在增加(P＜0.05)。同時，術后1天，脊髓損傷組逼尿肌P62有表達，但是術

4、后4天較假手術組表達減少，并持續(xù)到術后14天。RT-PCR結果顯示，在術后1天、4天、14天脊髓損傷組逼尿肌LC3mRNA表達較假手術組明顯增加，結果顯示在術后4天，術后4天脊髓損傷組大鼠膀胱逼尿肌LC3mRNA的表達較術后1天明顯增加，但是術后14天脊髓損傷組大鼠膀胱逼尿肌LC3mRNA的表達較術后4天有所減少;RT-PCR結果顯示，術后1天，脊髓損傷組大鼠膀胱逼尿肌P62mRNA表達與假手術組相比無明顯差別;術后4天和術后14天，脊

5、髓損傷組大鼠膀胱逼尿肌P62mRNA表達與假手術組相比明顯減少，但是，術后14天脊髓損傷組大鼠膀胱逼尿肌P62mRNA表達較術后4天有所增加。
　　研究結論:脊髓損傷后膀胱逼尿肌中自噬被激活，并持續(xù)相當長的一段時間;自噬的表達與膀胱功能和運動功能的恢復相一致，提示自噬可能參與膀胱和運動功能的恢復;自噬可能在神經源性膀胱發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮一定的作用，并可能參與膀胱逼尿肌的自我修復。
　　第二部分 3-MA通過抑制自噬反應對大鼠

6、脊髓損傷后神經源性膀胱的作用研究
　　研究目的:通過自噬抑制劑3-MA的干預，觀察對大鼠脊髓損傷后神經源性膀胱的影響及膀胱逼尿肌細胞中自噬的表達。
　　研究方法:27只雄性wistar大鼠隨機分為空白對照組，脊髓損傷組和3-MA注射組?？瞻讓φ战M只接受T10-T11水平的椎板切除術，而不損傷脊膜;脊髓損傷組和3-MA注射組大鼠采用改良的Allen's法進行脊髓損傷的手術，造模完成后，3-MA注射組大鼠腹腔注射3-MA(2mg

7、/kg)，脊髓損傷組和空白對照組注射同等劑量的生理鹽水。在術后1天、4天、14天進行運動評分、殘余尿量、膀胱功能評分，在每一個時間點，每組都隨機選出3只實驗動物被處死，取材。使用BBB功能評定量表評定大鼠的運動功能情況;使用膀胱殘余尿量和膀胱功能評分評估大鼠膀胱功能;Western blotting檢測大鼠膀胱組織中的LC3蛋白表達;應用免疫熒光法檢測自噬相關指標LC3、P62，觀察其陽性細胞表達;實時熒光定量RT-PCR對大鼠膀胱組織

8、檢測自噬活動相關基因LC3mRNA、P62mRNA水平。
　　研究結果:造模后，脊髓損傷組和3-MA注射組的下肢基本沒有運動功能，而假手術組的大鼠運動功能沒有受損。與脊髓損傷組相比，3-MA注射組的BBB評分降低，差距有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。從術后1天至術后14天，脊髓損傷組和3-MA注射組的膀胱殘余尿量逐漸減少，特別是術后3天至術后9天。但是，3-MA注射組的殘余尿量相比脊髓損傷組增加，差距具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

9、3-MA注射組術后比脊髓損傷組在術后1天、9天、12天、14天的膀胱功能評分降低，差距有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。Western blot結果顯示在術后1天、4天、14天3-MA注射組LC3-Ⅱ蛋白表達較脊髓損傷組均有所降低，差距有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。RT-PCR結果顯示在術后1天、4天、14天，3-MA注射組膀胱逼尿肌LC3 mRNA的表達比脊髓損傷組均有所降低，差距有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);在術后4天、14天，3-MA

10、注射組膀胱逼尿肌P62 mRNA的表達比脊髓損傷組均有所升高，差距有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。免疫熒光染色結果顯示在術后1天、4天、14天3-MA注射組LC3蛋白的陽性細胞率比脊髓損傷組均有所降低，差距有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);在術后1天、4天、14天3-MA注射組P62蛋白的陽性細胞率比脊髓損傷組均有所升高，差距有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　研究結論:腹腔內注射自噬抑制劑3-MA抑制了脊髓損傷后大鼠膀胱逼尿肌自噬的表

11、達，對膀胱功能的恢復和下肢運動功能的恢復產生影響，抑制了功能的恢復;進一步證實自噬可能參與脊髓損傷后神經源性膀胱的自我修復，對于膀胱逼尿肌細胞有一定的保護作用。
　　第三部分 自噬誘導劑雷帕霉素對大鼠脊髓損傷后神經源性膀胱的作用研究
　　研究目的:觀察自噬誘導劑雷帕霉素對大鼠脊髓損傷后神經源性膀胱的影響。
　　研究方法:15只雄性wistar大鼠隨機分為空白對照組，脊髓損傷組和雷帕霉素注射組。空白對照組只接受T10-T

12、11水平的椎板切除術，而不損傷脊膜;脊髓損傷組和雷帕霉素注射組大鼠采用改良的Allen's法進行脊髓損傷的手術，造模完成后，雷帕霉素注射組大鼠腹腔注射雷帕霉素(2mg/kg)，脊髓損傷組和空白對照組注射同等劑量的生理鹽水。在術后1天、3天、5天、7天、9天、11天、14天進行運動評分、殘余尿量、膀胱功能評分。使用BBB功能評定量表評定大鼠的運動功能情況;使用膀胱殘余尿量和膀胱功能評分評估大鼠膀胱功能。
　　研究結果:造模后，脊髓損

13、傷組和雷帕霉素注射組的下肢功能喪失，而假手術組大鼠下肢運動功能正常。術后1天開始，脊髓損傷組和雷帕霉素注射組的下肢功能逐漸恢復，隨時間呈上升趨勢。其中，在術后3天、5天、9天雷帕霉素注射組的BBB評分較脊髓損傷組升高，差距有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，在術后11天、14天差距有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。在術后7天、9天、11天、14天，雷帕霉素注射組的殘余尿量相比脊髓損傷組減少，差距有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。在術后1，3，5，