硫化氫對部分肝切除小鼠術(shù)后炎癥反應及認知功能的影響.pdf

1、目的：術(shù)后認知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction,POCD)是老年人麻醉和手術(shù)后常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥,主要表現(xiàn)為麻醉手術(shù)后學習、記憶等認知功能減退,可持續(xù)數(shù)周或數(shù)月,甚至可能持續(xù)存在。迄今為止,POCD確切發(fā)病機制尚不明確。既往研究發(fā)現(xiàn)POCD與圍術(shù)期機體固有免疫系統(tǒng)和炎癥級聯(lián)反應的激活以及多種促炎因子的釋放密切相關(guān),而且有研究報道針對圍術(shù)期炎癥反應的治療措施對POCD具有明顯的改善作用

2、。研究發(fā)現(xiàn),在多種哺乳動物腦組織中具有相對較高濃度的內(nèi)源性硫化氫(hydrogen sulfide,H2S),且后續(xù)的研究表明內(nèi)源性H2S在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等均有重要的生理作用,并參與一些疾病的病理生理過程。目前這種既往被認為具有臭雞蛋氣味的有害氣體受到了多個學科的廣泛關(guān)注,被認為是繼一氧化氮(Nitric oxide,NO)和一氧化碳(Carbon monoxide,CO)之后的第三種氣體信號分子。針對H2S在中樞神

3、經(jīng)系統(tǒng)作用的研究發(fā)現(xiàn),H2S能夠減輕氧化應激反應導致的神經(jīng)元損傷;改善脂多糖(Iipopolysaccharide,LPS)誘發(fā)的神經(jīng)炎癥反應、神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損害以及學習記憶功能障礙;對抗傷害性刺激導致的神經(jīng)細胞凋亡。此外,機體生理濃度的H2S能夠活化神經(jīng)元的ATP敏感性鉀通道,增強NMDA受體的活性而易化與學習記憶相關(guān)的海馬長時程記憶增強(Iong-termpotentiation,LTP)形成。因此可以推斷,外源性補充H2S可能會對中樞

4、神經(jīng)系統(tǒng)的損害起到保護作用。我們假設(shè)術(shù)前和術(shù)后早期外源性補充H2S對成年小鼠手術(shù)后的認知功能障礙具有改善作用。本實驗擬觀察手術(shù)前和手術(shù)后早期腹腔注射硫氫化鈉(NaHS,sodium hydrosulfide(H2S的一種供體))對成年小鼠肝臟部分切除手術(shù)后早期認知功能障礙的改善作用,并進一步探討可能涉及的機制。實驗采用Morris水迷宮對動物進行認知功能測試;酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-Iinked Immunosorbent ass

5、ay,ELISA)檢測動物手術(shù)后外周血促炎因子TNF-a、IL-1β、IL-6的濃度;Western blot法檢測動物手術(shù)后中樞海馬組織促炎因子TNF-a、IL-1β、IL-6的表達。
　　 方法：成年雄性昆明小鼠(N=120),隨機分為5組(n=24):生理鹽水對照組(NS組),硫氫化鈉組(NaHS組),假手術(shù)組(Sham組),手術(shù)組(Surgery組)和硫氫化鈉+手術(shù)組(NaHS+surgery組)。采用Morris水迷宮

6、進行認知功能測試,過程包括術(shù)前連續(xù)5天的定位航行實驗和在術(shù)后第1、3、7天進行的空間探索實驗兩部分。從定位航行實驗的第3天開始直到術(shù)后第3天,共7天,NS組、Sham組、Surgery組腹腔注射生理鹽水0.1 ml/10g·d-1,NaHS組、NariS+surgery組腹腔注射NaHS溶液5 mg/kg(生理鹽水稀釋,NaHS溶液濃度:50 umol/ml)。于第6天對Sham組、Surgery組及NaHS+surgery組動物進行手

7、術(shù)操作,動物采用神經(jīng)安定麻醉(即:芬太尼0.2 mg/kg,氟哌利多5 mg/kg腹腔注射)待動物反正反射消失后,固定、備皮、消毒腹部擬作切口區(qū),Sham組于腹部正中,從劍突下做一約2 cm切口,分層打開腹腔,切口曠置5 min后經(jīng)切口處腹腔注射生理鹽水0.3 ml以補充手術(shù)操作過程中的液體丟失。3＃線逐層縫合切口,完畢后再次消毒縫合后的切口;Surgery組和NaHS+surgery組動物麻醉方法及手術(shù)前的準備同Sham組,在逐層打開

8、動物腹腔后,無齒鑷輕柔鉗央肝臟左外側(cè)葉拉出切口,7＃絲線結(jié)扎肝臟左外側(cè)葉,切除結(jié)扎外側(cè)的肝臟組織,同樣經(jīng)切口處腹腔注射生理鹽水0.3 ml補充手術(shù)操作期間的液體丟失,3＃絲線逐層縫合切口,縫合完畢后再次消毒縫合后的切口。動物手術(shù)后單獨飼養(yǎng),注意保暖,觀察動物手術(shù)切口處有無出血等異常情況,待麻醉蘇醒、自主活動恢復后再次按術(shù)前的分組進行飼養(yǎng)。于術(shù)后第l、3、7天分別從各組中抽取8只動物進行空間探索實驗,測試環(huán)境同定位航行實驗。測試完畢后,動

9、物麻醉狀態(tài)下,經(jīng)眼眶采血后處死,迅速取出腦組織,分離海馬,立刻置于液氮中,后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中,保存?zhèn)溆?。?jīng)眼眶采取的外周血,室溫靜置2 h后,3000 g,4℃離心5 min,取上層血清于EP管中,-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用ELJSA檢測動物手術(shù)后外周血TNF-a、IL-Iβ、IL-6濃度;Western blot法檢測動物手術(shù)后海馬組織TNF-a、IL-1β、IL-6表達,
　　 結(jié)果：⑴動物Morris水迷宮實驗。術(shù)前定

10、位航行實驗：實驗動物經(jīng)過連續(xù)5天的定位航行訓練,各組的逃避潛伏期以及潛伏期內(nèi)游泳總路程隨著實驗天數(shù)增加而逐漸縮短,但同一時間點上述兩指標組間的比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),定位航行實驗過程中,各組動物的游泳速度比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);術(shù)后空間探索實驗:術(shù)后第1、3、7天,同一時間點各組動物游泳速度比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);術(shù)后第1天,與NS組比較,NaHS組目標象限停留時間百分比、穿臺次數(shù)無明顯變

11、化,差異均無統(tǒng)計學意義(p＞0.05),Sham組、Surgery組、NaHS+surgery組目標象限停留時間百分比、穿臺次數(shù)較NS組降低,差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);與Surgery組比較,Sham組、NaHS+surgery組目標象限停留時間百分比及穿臺次數(shù)較Surgery組高,差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。術(shù)后第3天,與NS組比較,NaHS組、Sham組、NaHS+surgery組目標象限停留時間百分比、穿臺次數(shù),差異

12、均無統(tǒng)計學意義(p＞0.05),Surgery組目標象限停留時間百分比、穿臺次數(shù)低于NS組,差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。術(shù)后第7天,Surgery組目標象限停留時間百分比、穿臺次數(shù)仍低于NS組,差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05),但NS組、NaHS組、Sham組和NaHS+surgery組,上述兩指標組間差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。⑵ELISA～檢測動物手術(shù)后血清促炎因子TNF-a、IL-1β、IL-6的濃度。與NS組比較,N

13、aHS組術(shù)后第1、3、7天,血清TNF-a、IL-1β、IL-6濃度未見明顯變化,差異均無統(tǒng)計學意義(p＞0.05);術(shù)后第1天,與NS組比較,Sham組、Surgery組、NaHS+surgery組血清TNF-a、IL-1β、IL-6濃度較NS組升高,差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);但Sham組及NaHS+surgery組血清TNF-a、IL-1β、IL-6濃度低于Surgery組,差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);術(shù)后第3天,NS

14、組、NaHS組、Sham組和NaHS+surgery組,四組間血清IL-1β、IL-6濃度比較,差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05),但Surgery組血清IL-1β、IL-6濃度高于NS組和Sham組,差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);而血清TNF-a濃度四組間的比較,差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05);術(shù)后第7天時,各組間血清TNF-a、IL-1β、IL-6濃度比較,差異均無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。⑶Western blot檢測動物術(shù)

15、后海馬組織促炎因子TNF-a、IL-1β、IL-6表達。術(shù)后第1天,與NS組比較,NaHS組、Sham組及NaHS+surgery海馬組織TNF-a、IL-1β、IL-6表達未見明顯升高,各組間差異均無統(tǒng)計學意義(p＞0.05),Surgery組術(shù)后第1天,海馬組織TNF-a、IL-1β、IL-6表達水平較其余四組組升高,差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);術(shù)后第3天,與NS組比較,NaHS組、Sham組和NaHS+surgery組海馬組

16、織TNF-a表達差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05),但Surgery組海馬組織IL-1β、IL-6表達仍高于NS組,差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);術(shù)后第7天,各組海馬組織TNF-a、IL-1β、IL-6表達比較,差異均無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。
　　 結(jié)論：①對于成年小鼠,手術(shù)創(chuàng)傷能夠引起術(shù)后早期的認知功能障礙;圍術(shù)期激活的外周和中樞炎癥反應可能參與術(shù)后認知功能障礙形成。②術(shù)前和術(shù)后早期腹腔注射硫化氫能夠改善肝臟部分切除小