轉(zhuǎn)錄因子C-EBPα在腎間質(zhì)纖維化中的表達(dá)及作用研究.pdf

1、終末期腎病（end stage renal disease，ESRD）是各種慢性腎臟病(Chronic Kidney Disease,CKD)進(jìn)展的最終結(jié)果。CKD的發(fā)病率高，知曉率低。上海瑞金醫(yī)院的調(diào)查研究顯示，上海地區(qū)人群CKD患病率為11.8％，知曉率僅為8.2%。
　　CKD的病理進(jìn)展過程以腎功能的進(jìn)行性喪失（細(xì)胞的壞死和凋亡）、細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix，ECM）的大量積聚所致廣泛腎纖維化為特征

2、，主要包括腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化[1,2]。同時(shí)在腎間質(zhì)纖維化過程中，各種轉(zhuǎn)錄因子在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。核因子-κB（NF-κB）可以通過參與調(diào)節(jié)腎小管細(xì)胞功能中的多個(gè)路徑、及炎癥因子的分泌誘導(dǎo)過程，在腎間質(zhì)纖維化的過程中扮演重要角色。過氧化物酶體增殖物激活受體（Peroxisome Proliferator-Activated Receptor，PPARγ）亦被多項(xiàng)研究證實(shí)參與腎間質(zhì)纖維化的多種路徑包括抑制EM

3、T、抑制ECM沉積、及抑制多種炎癥及細(xì)胞因子分泌等。本學(xué)科前期利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺(tái)，通過 iTRAQ-2D-nano-HPLC-MS/MS技術(shù)篩選出靶標(biāo)蛋白之一 C/EBPα（CAAT/enhancer binding proteins，C/EBPα），初步研究提示轉(zhuǎn)錄因子 C/EBPα在腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展中具有一定作用。因此基于前期結(jié)果，本研究旨在繼續(xù)探究轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα在腎臟疾病發(fā)病過程中的作用機(jī)制，及其在腎間質(zhì)纖維化中與上述

4、兩種轉(zhuǎn)錄因子是否有相互作用，為延緩腎臟纖維化提供可能的治療靶點(diǎn)。
　　本研究分為兩部分。
　　第一部分：利用TGFβ1（轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1，transforming growth factorβ1）作為刺激因子，人腎小管上皮細(xì)胞株HK-2作為研究對(duì)象，研究TGFβ1致纖維化過程中，過表達(dá) C/EBPα或C/EBPα的抑制對(duì)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等病理過程的影響。首先利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正常的HK-2細(xì)胞觀察單純轉(zhuǎn)染 C/EBPα之后對(duì)轉(zhuǎn)錄

5、因子 PPARγ、NF-κB的表達(dá)影響。轉(zhuǎn)染C/EBPα24h，TGFβ1（10ng/ml）刺激12h，觀察ColⅠ、PPARγ、C/EBPα的mRNA表達(dá)情況。同時(shí)利用siRNA沉默C/EBPα表達(dá)，利用TGFβ1 （5ng/ml）刺激HK-2細(xì)胞，不同時(shí)間（0h、4h、12h、24h），觀察C/EBPα的低表達(dá)對(duì)細(xì)胞內(nèi)炎癥因子分泌的影響；利用TGFβ1（10ng/ml）刺激轉(zhuǎn)染C/EBPα質(zhì)粒的HK-2細(xì)胞12h，流式細(xì)胞

6、術(shù)觀察細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果表明，三種方法均可驗(yàn)證過表達(dá)C/EBPα是成功的，其轉(zhuǎn)染效率在70-80%以上。HK-2轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Control質(zhì)粒、pEGFP-N1-C/EBPα質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-C/EBPα質(zhì)粒組與轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Control質(zhì)粒組和control組相比，PPARγ、NF-κB的蛋白表達(dá)無顯著差異。SiRNA沉默C/EBPα表達(dá)，siRNA-C/EBPα組、siRNA-control

7、組和control組四個(gè)時(shí)間點(diǎn)上清液中的MCP-1蛋白水平變化一致，即均在12h、24h有明顯升高，且轉(zhuǎn)染siRNA-C/EBPα組與siRNA-control組、control組相比，基礎(chǔ)狀態(tài)、4h、12h、24h的MCP-1表達(dá)水平均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。TGFβ1刺激轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Control質(zhì)粒、pEGFP-N1- C/EBPα質(zhì)粒和control組HK-2細(xì)胞，可誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡。HK-2細(xì)胞的早晚期凋亡和總凋亡數(shù)目

8、在pEGFP-N1-Control質(zhì)粒組和pEGFP-N1-C/EBPα質(zhì)粒組間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。RT-qPCR結(jié)果顯示TGFβ1刺激使C/EBPα表達(dá)降低，Control組、pEGFP-N1-Control組、pEGFP-N1- C/EBPα組相較于基礎(chǔ)值分別下降65%、74%及38%，PPARγ則分別下降66%、50%、50%。而ColⅠ的表達(dá)在TGFβ110ng/ml作用下Control組、pEGFP-N1-Control組、pE

9、GFP-N1-C/EBPα組相較于基礎(chǔ)值分別升高10倍、7倍和4.5倍。
　　第二部分：利用C/EBPα-floxp小鼠和pepck-cre小鼠，建立C/EBPα在腎小管上皮細(xì)胞特異性敲除的動(dòng)物模型。通過兩代交配產(chǎn)生在腎小管上皮細(xì)胞雜合敲除的小鼠，并鑒定子代小鼠的基因型，取雄性雜合敲除小鼠進(jìn)行UUO模型制作。雜合敲除及野生型小鼠均構(gòu)建UUO模型，時(shí)間點(diǎn)為7天，利用常規(guī)病理染色和RT-qPCR觀察各組腎間質(zhì)纖維化情況。病理染色顯示K

10、O小鼠病變嚴(yán)重。RT-qPCR顯示在UUO模型中C/EBPα的表達(dá)較control組明顯下降。WT-UUO組的NF-κB較WT-control組升高1.38倍，KO小鼠術(shù)側(cè)組較KO小鼠非術(shù)側(cè)組升高2.3倍。同時(shí)應(yīng)用BALB/c小鼠構(gòu)建UUO模型并予白藜蘆醇（Resveratrol，ResV）干預(yù)，RT-qPCR觀察對(duì)C/EBPα表達(dá)的影響。ResV-UUO組較UUO組升高2倍。此外，應(yīng)用RT-qPCR方法觀察白藜蘆醇對(duì) NF-κB、Ec

11、adherin、α-SMA表達(dá)的影響，與 BALB/c假手術(shù)組相比，BALB/cUUO模型組和BALB/c白藜蘆醇處理UUO組分別增加2.9、2.1倍，α-SMA則分別增加4.0倍和1.3倍，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Ecadherin分別減少80%和24%。以上結(jié)果表明白藜蘆醇處理通過抑制 EMT及轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB表達(dá)延緩腎間質(zhì)纖維化進(jìn)展。
　　綜上所述，C/EBPα在腎間質(zhì)纖維化過程中表達(dá)水平降低，TGFβ1刺激使C/EBPα表達(dá)降