肝纖維化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理及保肝寧干預(yù)研究.pdf

1、目的：研究保肝寧對活化星狀細(xì)胞HSC-T6增殖的影響；探討保肝寧對cAMP反應(yīng)序列結(jié)合蛋白(cAMP-responsiveelementbindingprotein，CREB)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nucleartranscriptionalfactor-κB，NF-κB)、NF-κB抑制因子(inhibit-κB，IκB)以及Zf9的作用；研究保肝寧在HSC-T6對轉(zhuǎn)化生長因子β(transforminggrowthfactorβ，TG

2、F-β)的調(diào)節(jié)機(jī)制，試圖闡明保肝寧抗肝纖維化的可能機(jī)制。 方法：一、體外實(shí)驗(yàn)：給正常Wistar大鼠隨機(jī)分組，每組4只，采用血清藥理學(xué)方法，分組給予保肝寧單倍劑量煎劑(1.215g/ml)、保肝寧二倍劑量煎劑(2.43g/m1)、秋水仙堿(0.027g/m1)和復(fù)方鱉甲軟肝片(0.108g/m1)灌胃7天，陰性對照組大鼠給予生理鹽水，常規(guī)方法制備含藥血清及正常大鼠血清。將HSC-T6細(xì)胞傳代培養(yǎng)，分組給予藥物血清培養(yǎng)基及正常大鼠

3、血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，采用甲基噻唑基四唑(methylthiazolyltetrazolium，MTT)比色法、蛋白質(zhì)印跡法(WesternBlot)及凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(Electrophoreticmobility-shiftassay,EMSA)觀察保肝寧對肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecell，HSC)增殖的影響以及對HSC內(nèi)CREB、NF-κB、IκB、Zf9以及TGF-β表達(dá)及活性的影響； 二、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：牛血清白

4、蛋白免疫攻擊尾靜脈注射制作大鼠免疫性肝纖維化模型，四組造模動物分別給予單倍劑量的保肝寧煎劑(保肝寧組)、二倍劑量的保肝寧煎劑(二倍保肝寧組)、生理鹽水(模型組)和復(fù)方鱉甲軟肝片(復(fù)方鱉甲軟肝片組)；另設(shè)正常培養(yǎng)的大鼠，尾靜脈注射生理鹽水，作為陰性對照組。應(yīng)用蘇木精和伊紅(HaematoxylinEosin，HE)染色觀察肝組織病理改變；檢測大鼠血清透明質(zhì)酸(Hyaluronicacid，HA)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanineaminotra

5、nsferase，ALT)含量；免疫組化法(Immunohistochemistry)觀察肝臟內(nèi)磷酸化-CREB的表達(dá)情況。 通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)探討保肝寧對核轉(zhuǎn)錄因子CREB、NF-κB、IκB、Zf9以及炎癥刺激因子TGF-β的調(diào)節(jié)作用，了解保肝寧抗肝纖維化的可能機(jī)制。 結(jié)果：一、與正常大鼠血清組相比，保肝寧組、兩倍保肝寧組均能明顯抑制HSC-T6細(xì)胞的增殖(P＜0.01)，復(fù)方鱉甲軟肝片組、秋水仙堿組亦能抑制HSC-

6、T6細(xì)胞的增殖(P＜0.05)；與復(fù)方鱉甲軟肝片組、秋水仙堿組相比，保肝寧組、兩倍保肝寧組明顯抑制HSC-T6細(xì)胞的增殖(P＜0.05)，但保肝寧組與兩倍保肝寧組間未見顯著性差異(P＞0.05)。 二、保肝寧作用10min后CREB磷酸化水平比正常血清組有較明顯升高，30min達(dá)到最高水平，2、4hCREB磷酸化水平有所下降，至6h與正常血清組無顯著差異，恢復(fù)至原來水平；而相同實(shí)驗(yàn)條件下保肝寧作用10min、30min、2h、4

7、h、6h后，CREB蛋白水平保持恒定，與未加藥組CREB蛋白水平相當(dāng)，無明顯差異；與正常組、復(fù)方鱉甲軟肝片組、秋水仙堿組比較，保肝寧能明顯提高CREB磷酸化水平；保肝寧作用不同時間后HSC內(nèi)CREB與DNA結(jié)合水平保持不變，與正常血清組對照水平相當(dāng)。 三、經(jīng)保肝寧作用10min后IκB磷酸化水平比正常血清組有較明顯降低，30min達(dá)到最低水平，2、4hIκB磷酸化水平有所上升，至6h與正常血清組無顯著差異，恢復(fù)至原來水平；與正常

8、組、秋水仙堿組比較，保肝寧組能明顯降低IκB磷酸化水平；同時與正常血清組比較，保肝寧組NF-κB與DNA結(jié)合水平明顯下降。 四、與正常血清組、秋水仙堿組比較，保肝寧組Zf9與DNA結(jié)合水平明顯下降；同時保肝寧組TGF-β1水平比正常血清組、秋水仙堿組有明顯降低。五、牛血清白蛋白免疫攻擊造成的免疫性肝纖維化大鼠模型經(jīng)不同藥物處理后，根據(jù)肝纖維化分級比較，與正常組相比，模型組、保肝寧組和復(fù)方鱉甲軟肝片組肝纖維化程度增加，其差異有顯著

9、性意義(P＜0.01)，與模型組相比，保肝寧組和復(fù)方鱉甲軟肝片組肝纖維化程度顯著降低，其差異有顯著性意義(P＜0.05)，二倍保肝寧組肝纖維化程度降低更顯著(P＜0.01)；保肝寧組與復(fù)方鱉甲軟肝片組相比，肝纖維化程度表達(dá)差異無顯著性意義(P＞0.05)，保肝寧組與二倍保肝寧組之間比較亦無顯著性差異(P＞0.05)。與正常組比較，模型組、復(fù)方鱉甲軟肝片組血清ALT、HA表達(dá)顯著性增高，其差異有顯著性意義(P＜0.01)，保肝寧組與二倍保

10、肝寧組亦有所增高(P＜0.05)；與模型組比較，保肝寧組和復(fù)方鱉甲軟肝片組血清ALT、HA表達(dá)顯著降低，其差異有顯著性意義(P＜0.01)，與保肝寧組比較，復(fù)方鱉甲軟肝片組血清ALT、HA表達(dá)顯著性增高，其差異有顯著性意義(P＜0.05)，但保肝寧組與二倍保肝寧組之間比較無顯著性差異(P＞0.05)。 六、免疫組化結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組磷酸化-CREB表達(dá)顯著性降低，其差異有顯著性意義(P＜0.05)，保肝寧組與二倍保肝

11、寧組磷酸化-CREB表達(dá)顯著性增高(P＜0.05及P＜0.01)，而復(fù)方鱉甲軟肝片組磷酸化-CREB表達(dá)沒有顯著性差異(P＞0.05)；與模型組比較，保肝寧組和二倍保肝寧組磷酸化-CREB表達(dá)顯著增高，其差異有顯著性意義(P＜0.01)，復(fù)方鱉甲軟肝片組表達(dá)亦增高(P＜0.05)。與復(fù)方鱉甲軟肝片組比較，保肝寧組磷酸化-CREB表達(dá)顯著增高(P＜0.05)。 結(jié)論：一、保肝寧抑制HSC的增殖； 二、保肝寧促進(jìn)HSC-T6