肝纖維化的轉錄調控機理及保肝寧干預研究.pdf

1、目的：研究保肝寧對活化星狀細胞HSC-T6增殖的影響；探討保肝寧對cAMP反應序列結合蛋白(cAMP-responsiveelementbindingprotein，CREB)、核轉錄因子-κB(nucleartranscriptionalfactor-κB，NF-κB)、NF-κB抑制因子(inhibit-κB，IκB)以及Zf9的作用；研究保肝寧在HSC-T6對轉化生長因子β(transforminggrowthfactorβ，TG

2、F-β)的調節(jié)機制，試圖闡明保肝寧抗肝纖維化的可能機制。 方法：一、體外實驗：給正常Wistar大鼠隨機分組，每組4只，采用血清藥理學方法，分組給予保肝寧單倍劑量煎劑(1.215g/ml)、保肝寧二倍劑量煎劑(2.43g/m1)、秋水仙堿(0.027g/m1)和復方鱉甲軟肝片(0.108g/m1)灌胃7天，陰性對照組大鼠給予生理鹽水，常規(guī)方法制備含藥血清及正常大鼠血清。將HSC-T6細胞傳代培養(yǎng)，分組給予藥物血清培養(yǎng)基及正常大鼠

3、血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，采用甲基噻唑基四唑(methylthiazolyltetrazolium，MTT)比色法、蛋白質印跡法(WesternBlot)及凝膠阻滯實驗(Electrophoreticmobility-shiftassay,EMSA)觀察保肝寧對肝星狀細胞(hepaticstellatecell，HSC)增殖的影響以及對HSC內CREB、NF-κB、IκB、Zf9以及TGF-β表達及活性的影響； 二、體內實驗：牛血清白

4、蛋白免疫攻擊尾靜脈注射制作大鼠免疫性肝纖維化模型，四組造模動物分別給予單倍劑量的保肝寧煎劑(保肝寧組)、二倍劑量的保肝寧煎劑(二倍保肝寧組)、生理鹽水(模型組)和復方鱉甲軟肝片(復方鱉甲軟肝片組)；另設正常培養(yǎng)的大鼠，尾靜脈注射生理鹽水，作為陰性對照組。應用蘇木精和伊紅(HaematoxylinEosin，HE)染色觀察肝組織病理改變；檢測大鼠血清透明質酸(Hyaluronicacid，HA)和谷丙轉氨酶(alanineaminotra

5、nsferase，ALT)含量；免疫組化法(Immunohistochemistry)觀察肝臟內磷酸化-CREB的表達情況。 通過體內和體外實驗探討保肝寧對核轉錄因子CREB、NF-κB、IκB、Zf9以及炎癥刺激因子TGF-β的調節(jié)作用，了解保肝寧抗肝纖維化的可能機制。 結果：一、與正常大鼠血清組相比，保肝寧組、兩倍保肝寧組均能明顯抑制HSC-T6細胞的增殖(P＜0.01)，復方鱉甲軟肝片組、秋水仙堿組亦能抑制HSC-

6、T6細胞的增殖(P＜0.05)；與復方鱉甲軟肝片組、秋水仙堿組相比，保肝寧組、兩倍保肝寧組明顯抑制HSC-T6細胞的增殖(P＜0.05)，但保肝寧組與兩倍保肝寧組間未見顯著性差異(P＞0.05)。 二、保肝寧作用10min后CREB磷酸化水平比正常血清組有較明顯升高，30min達到最高水平，2、4hCREB磷酸化水平有所下降，至6h與正常血清組無顯著差異，恢復至原來水平；而相同實驗條件下保肝寧作用10min、30min、2h、4

7、h、6h后，CREB蛋白水平保持恒定，與未加藥組CREB蛋白水平相當，無明顯差異；與正常組、復方鱉甲軟肝片組、秋水仙堿組比較，保肝寧能明顯提高CREB磷酸化水平；保肝寧作用不同時間后HSC內CREB與DNA結合水平保持不變，與正常血清組對照水平相當。 三、經保肝寧作用10min后IκB磷酸化水平比正常血清組有較明顯降低，30min達到最低水平，2、4hIκB磷酸化水平有所上升，至6h與正常血清組無顯著差異，恢復至原來水平；與正常

8、組、秋水仙堿組比較，保肝寧組能明顯降低IκB磷酸化水平；同時與正常血清組比較，保肝寧組NF-κB與DNA結合水平明顯下降。 四、與正常血清組、秋水仙堿組比較，保肝寧組Zf9與DNA結合水平明顯下降；同時保肝寧組TGF-β1水平比正常血清組、秋水仙堿組有明顯降低。五、牛血清白蛋白免疫攻擊造成的免疫性肝纖維化大鼠模型經不同藥物處理后，根據肝纖維化分級比較，與正常組相比，模型組、保肝寧組和復方鱉甲軟肝片組肝纖維化程度增加，其差異有顯著

9、性意義(P＜0.01)，與模型組相比，保肝寧組和復方鱉甲軟肝片組肝纖維化程度顯著降低，其差異有顯著性意義(P＜0.05)，二倍保肝寧組肝纖維化程度降低更顯著(P＜0.01)；保肝寧組與復方鱉甲軟肝片組相比，肝纖維化程度表達差異無顯著性意義(P＞0.05)，保肝寧組與二倍保肝寧組之間比較亦無顯著性差異(P＞0.05)。與正常組比較，模型組、復方鱉甲軟肝片組血清ALT、HA表達顯著性增高，其差異有顯著性意義(P＜0.01)，保肝寧組與二倍保

10、肝寧組亦有所增高(P＜0.05)；與模型組比較，保肝寧組和復方鱉甲軟肝片組血清ALT、HA表達顯著降低，其差異有顯著性意義(P＜0.01)，與保肝寧組比較，復方鱉甲軟肝片組血清ALT、HA表達顯著性增高，其差異有顯著性意義(P＜0.05)，但保肝寧組與二倍保肝寧組之間比較無顯著性差異(P＞0.05)。 六、免疫組化結果顯示：與正常組比較，模型組磷酸化-CREB表達顯著性降低，其差異有顯著性意義(P＜0.05)，保肝寧組與二倍保肝

11、寧組磷酸化-CREB表達顯著性增高(P＜0.05及P＜0.01)，而復方鱉甲軟肝片組磷酸化-CREB表達沒有顯著性差異(P＞0.05)；與模型組比較，保肝寧組和二倍保肝寧組磷酸化-CREB表達顯著增高，其差異有顯著性意義(P＜0.01)，復方鱉甲軟肝片組表達亦增高(P＜0.05)。與復方鱉甲軟肝片組比較，保肝寧組磷酸化-CREB表達顯著增高(P＜0.05)。 結論：一、保肝寧抑制HSC的增殖； 二、保肝寧促進HSC-T6