有機(jī)錫化合物DBDCT對(duì)孕烷X受體(PXR)介導(dǎo)的CYP3A代謝酶的影響.pdf

1、目的：
　　進(jìn)一步確證有機(jī)錫化合物二-(4-氯苯甲酰異羥肟酸)二正丁基合錫（DBDCT）對(duì)細(xì)胞色素P4503A（CYP3A）抑制作用機(jī)制。本文研究DBDCT對(duì)孕烷X受體（PXR）介導(dǎo)CYP3A表達(dá)的影響，分析PXR是否參與DBDCT對(duì)CYP3A的抑制過(guò)程，考察DBDCT是否可以引起核因子κB（NF-κB）的活化，以及NF-κB對(duì)PXR介導(dǎo)CYP3A表達(dá)途徑的影響，探討DBDCT是否可以通過(guò)活化NF-κB抑制PXR介導(dǎo)的CYP3A轉(zhuǎn)

2、錄表達(dá)過(guò)程。
　　方法：
　?。?）利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，研究DBDCT對(duì)PXR介導(dǎo)的CYP3A轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響；（2）采用Western blot方法分別對(duì)DBDCT作用前后的HepG2細(xì)胞全蛋白、胞漿蛋白、胞核蛋白進(jìn)行檢測(cè)，分析DBDCT作用前后NF-κB總量的變化及其在胞漿、胞核中表達(dá)量變化情況；同時(shí)，采用免疫熒光法研究DBDCT作用前后NF-κB由胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)的情況，以研究NF-κB是否可以被DBDCT激活

3、；（3）采用熒光定量PCR（FQ-PCR）方法和雙熒光素報(bào)告酶實(shí)驗(yàn)，研究DBDCT激活的NF-κB對(duì)DBDCT作用后PXR介導(dǎo)的CYP3A轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)途徑的影響；（4）利用RNA干擾技術(shù)分別干擾PXR和NF-κB的表達(dá)，采用FQ-PCR方法檢測(cè)DBDCT對(duì)HepG2細(xì)胞中CYP3A mRNA表達(dá)水平的影響，驗(yàn)證DBDCT對(duì)CYP3A的抑制過(guò)程與PXR和NF-κB的關(guān)系，進(jìn)一步明確抑制作用的機(jī)制。
　　結(jié)果：
　?。?）DBDCT

4、可以誘導(dǎo)人或大鼠PXR介導(dǎo)的CYP3A基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，且呈量效關(guān)系，與空白對(duì)照組相比，0.5μM、1μM和2μM的DBDCT作用24h可以通過(guò)rPXR誘導(dǎo)CYP3A1表達(dá)升高至1.37、2.06和4.34倍（p<0.05、p<0.001、p<0.001），以這三種濃度的DBDCT作用24h后hPXR介導(dǎo)的CYP3A4表達(dá)升高至2.16、3.72及4.86倍（p<0.05、p<0.001、p<0.001）；同時(shí)該誘導(dǎo)作用也存在良好的時(shí)效關(guān)系

5、，以0.5μM的DBDCT分別作用24h、48h、72h，結(jié)果顯示作用時(shí)間越長(zhǎng)對(duì)PXR介導(dǎo)CYP3A表達(dá)的誘導(dǎo)作用越強(qiáng)。（2）Western blot法測(cè)得DBDCT作用前后細(xì)胞全蛋白中NF-κB的表達(dá)量未見(jiàn)顯著性變化（p>0.05），但與空白對(duì)照組相比1μM和2μM的DBDCT可使細(xì)胞胞漿中NF-κB的表達(dá)量下降至0.70和0.61倍（p<0.01、p<0.01），使細(xì)胞核內(nèi)NF-κB的表達(dá)量增至1.31和2.00倍（p<0.01、p

6、<0.01）。免疫熒光法也證明DBDCT作用后NF-κB由胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)至胞核，提示DBDCT可以活化NF-κB。（3）NF-κB的激活劑LPS可以使CYP3A4的mRNA表達(dá)水平明顯下降；DBDCT也可以使CYP3A4的mRNA表達(dá)水平降低，且該作用可以由NF-κB抑制劑PDTC逆轉(zhuǎn)。此外，在雙熒光素報(bào)告酶實(shí)驗(yàn)中，向轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中加入DBDCT可誘導(dǎo)CYP3A4表達(dá)升高，共轉(zhuǎn)染時(shí)加入NF-κB質(zhì)粒后該誘導(dǎo)作用被下調(diào)，下調(diào)程度隨著NF-κB的

7、加入量的增加而增加，共轉(zhuǎn)染時(shí)加入NF-κB的抑制因子IκBα可以減弱NF-κB質(zhì)粒對(duì)CYP3A4表達(dá)的影響。這些結(jié)果顯示DBDCT對(duì)CYP3A4的抑制作用與NF-κB相關(guān)。（4）0.5μM、1μM和2μM的DBDCT對(duì)CYP3A4 mRNA的表達(dá)水平均有下調(diào)作用，與空白對(duì)照組相比表達(dá)量分別降低至0.75、0.64和0.44倍（p<0.05、p<0.05、p<0.01）。干擾PXR表達(dá)后，DBDCT對(duì)CYP3A4 mRNA表達(dá)具有更強(qiáng)的抑