孕烷X受體介導(dǎo)的藥物代謝酶CYP3A4誘導(dǎo)表達(dá)的表觀遺傳學(xué)機(jī)制.pdf

1、目的:
　　細(xì)胞色素P450酶3A4(cytochrome P4503A4，CYP3A4)是人體中重要的藥物代謝酶，它能夠氧化代謝臨床上大約60％的藥物。CYP3A4的表達(dá)和活性在不同個(gè)體間存在非常大的差異且難以預(yù)測(cè)和評(píng)估。既往研究已表明，CYP3A4的表達(dá)能被多種臨床常用藥物誘導(dǎo)和抑制，這是導(dǎo)致CYP3A4表達(dá)和活性個(gè)體差異的一個(gè)重要原因，而且會(huì)引起藥物相互作用和不良反應(yīng)的發(fā)生，對(duì)藥物研發(fā)和臨床安全用藥造成了很大的困擾。以往的研

2、究主要集中于遺傳因素如單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)對(duì)CYP3A4表達(dá)的影響，然而SNP在人群中的分布頻率普遍較低且僅能解釋大約10-30％的個(gè)體差異。
　　近年來(lái)的研究表明，表觀遺傳修飾能從多個(gè)水平上參與藥物代謝酶基因的表達(dá)調(diào)控，如DNA甲基化、組蛋白甲基化和乙?；⒎蔷幋aRNA(non-codingRNA)等。組蛋白修飾是一種重要的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，組蛋白甲基化和乙?；?/p>

3、修飾與基因的轉(zhuǎn)錄激活與抑制有著密切聯(lián)系，是細(xì)胞生命活動(dòng)中重要的調(diào)節(jié)機(jī)制。孕烷X受體(pregnane X receptor，PXR)是肝臟中重要的核受體，CYP3A4的基因表達(dá)受PXR的調(diào)控，但其確切的調(diào)控機(jī)制不十分清楚，是否需要有其他關(guān)鍵因子協(xié)同其調(diào)控CYP3A4表達(dá)？已有研究表明組蛋白甲基化和乙?；谝恍〤YPs的基因表達(dá)中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用，但組蛋白修飾對(duì)PXR介導(dǎo)的CYP3A4誘導(dǎo)表達(dá)的影響尚未見報(bào)道。本研究提出假設(shè):藥物激活P

4、XR可通過(guò)募集相關(guān)的輔激活因子如核受體輔激活因子6(nuclear receptor coactivator6，NCOA6)和組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶p300等，識(shí)別CYP3A4基因啟動(dòng)子區(qū)PXR的結(jié)合位點(diǎn)并引起組蛋白修飾的改變，從而激活CYP3A4的轉(zhuǎn)錄。
　　已有研究報(bào)道m(xù)icroRNA作為一種特殊的表觀遺傳學(xué)修飾，可以通過(guò)直接靶向CYP3A4的3'端非編碼區(qū)(3'-untranslated region，3'-UTR)而調(diào)控其表達(dá)

5、，或通過(guò)靶向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子如PXR等間接影響CYP3A4的表達(dá)。然而，miRNA在藥物誘導(dǎo)CYP3A4表達(dá)中的作用及機(jī)制尚未見報(bào)道。
　　綜上，本課題擬從組蛋白甲基化、乙?；揎椇蚼iRNA調(diào)控的角度探討PXR配體利福平誘導(dǎo)CYP3A4基因表達(dá)調(diào)控的表觀遺傳機(jī)制，主要從以下幾個(gè)方面展開研究:①組蛋白修飾在利福平誘導(dǎo)CYP3A4表達(dá)中的作用及機(jī)制;②miRNA在利福平誘導(dǎo)CYP3A4表達(dá)中的作用及機(jī)制;③人肝臟組織中miRNA表達(dá)和組

6、蛋白修飾與CYP3A4基礎(chǔ)表達(dá)個(gè)體差異的關(guān)系。該研究為闡明藥物代謝酶?jìng)€(gè)體差異的分子機(jī)制提供理論依據(jù)，以期有助于新藥研發(fā)和指導(dǎo)臨床合理用藥。
　　材料與方法:
　　1.人肝臟組織標(biāo)本的收集
　　本研究所用肝臟組織樣本從鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院收集，標(biāo)本來(lái)源為肝血管瘤、膽囊癌、肝膽管結(jié)石等患者進(jìn)行肝部分切除術(shù)所獲得的正常肝臟組織。所有樣本已排除肝炎及其他傳染性疾病，且患者肝、腎功能正常。研究方案經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委

7、員會(huì)的批準(zhǔn)，所有標(biāo)本的收集均獲得患者的同意并在手術(shù)前簽署了知情同意書。樣本保存于液氮中直至實(shí)驗(yàn)。
　　2.CYP3A4在肝細(xì)胞中的誘導(dǎo)表達(dá)和人肝臟組織中表達(dá)的測(cè)定
　　本研究經(jīng)過(guò)篩選后使用LS174T和HepaRG兩種細(xì)胞系作為利福平誘導(dǎo)CYP3A4表達(dá)的模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用利福平（10μM）誘導(dǎo)LS174T細(xì)胞和HepaRG細(xì)胞后，以Trizol法提取總RNA并采用一步法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用Reai-timequantit

8、ative PCR(qPCR)和Western Blot檢測(cè)CYP3A4誘導(dǎo)表達(dá)水平，并檢測(cè)CYP3A4在人肝臟組織中的mRNA和蛋白基礎(chǔ)表達(dá)水平。
　　3.RNA干擾實(shí)驗(yàn)
　　分別構(gòu)建特異性靶向目標(biāo)基因PXR、NCOA6和p300的shRNA表達(dá)載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后通過(guò)嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。檢測(cè)PXR、NCOA6和p300表達(dá)的下調(diào)作用并分析對(duì)利福平誘導(dǎo)效應(yīng)的影響以及對(duì)組蛋白修飾的影響。
　　4.染色質(zhì)免疫共沉

9、淀(Chromatin Immunoprecipitation，CHIP)分析CYP3A4基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白修飾水平
　　將利福平誘導(dǎo)后的細(xì)胞用1％甲醛溶液交聯(lián)后進(jìn)行超聲破碎剪切DNA片段，分別使用相應(yīng)的抗體進(jìn)行免疫共沉淀，用qPCR分析利福平對(duì)CYP3A4基因啟動(dòng)子區(qū)PXR結(jié)合區(qū)域H3K4三甲基化(H3K4me3)、H3K27三甲基化(H3K27me3)和H3乙?；?H3ac)水平以及對(duì)PXR、NCOA6和p300結(jié)合的影響。<

10、br>　　5.細(xì)胞免疫熒光（Immunofluorescence，IF）和免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation，Co-IP)檢測(cè)蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的定位及相互作用
　　制備LS174T細(xì)胞爬片并給予利福平（10μM）誘導(dǎo)48 h，根據(jù)細(xì)胞免疫熒光步驟操作并使用激光共聚焦顯微鏡觀察PXR、NCOA6、p300蛋白在細(xì)胞中的分布及共定位狀態(tài)。收集利福平誘導(dǎo)后的LS174T細(xì)胞并提取總蛋白，用NCOA6或p300的抗體進(jìn)

11、行Co-IP實(shí)驗(yàn)，分析PXR和NCOA6/p300之間的蛋白質(zhì)相互作用。
　　6.利福平對(duì)HepaRG細(xì)胞中miRNA表達(dá)的影響
　　使用mirVanaTM miRNA提取試劑盒提取HepaRG細(xì)胞總RNA，通過(guò)HumanmiRNA array V4.0表達(dá)譜芯片(Affymetrix)檢測(cè)miRNA的表達(dá)。使用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)篩選能夠靶向CYP3A4的差異表達(dá)miRNA，并通過(guò)qPCR分析驗(yàn)證利福平對(duì)miRNA表達(dá)的影響。構(gòu)

12、建攜帶CYP3A43'-UTR全長(zhǎng)的熒光素酶報(bào)告基因載體并對(duì)miRNA可能的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，通過(guò)報(bào)告基因篩選并明確調(diào)控CYP3A4的miRNA。
　　7.人肝臟組織中miRNA表達(dá)和組蛋白修飾水平的檢測(cè)
　　通過(guò)Real-time qPCR檢測(cè)所收集的人肝臟組織中miRNA的表達(dá)，ChIP-qPCR分析部分組織樣本CYP3A4基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白修飾水平，并與CYP3A4的表達(dá)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

13、　　數(shù)據(jù)以均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組之間的均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組之間均值的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni's post hoc test或Dunnett'stest進(jìn)行分析，關(guān)聯(lián)分析采用spearman相關(guān)性分析，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS軟件進(jìn)行。以P值小于0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　?。ㄒ唬┙M蛋白修飾在利福平誘導(dǎo)CYP3A4表達(dá)中的作用及機(jī)制
　　1.利福平對(duì)LS174

14、T細(xì)胞中CYP3A4表達(dá)的誘導(dǎo)作用
　　與對(duì)照組(0.1％ v/v，DMSO)比，利福平(10μM)能夠上調(diào)LS174T細(xì)胞中CYP3A4的mRNA(4～15倍，P＜0.05)和蛋白（1.6～2.9倍，P＜0.05）的表達(dá)且呈時(shí)間依賴性，而通過(guò)shRNA干擾PXR的表達(dá)后則顯著降低利福平對(duì)CYP3A4的誘導(dǎo)作用（下調(diào)70％，P＜0.05），該結(jié)果提示利福平誘導(dǎo)CYP3A4的表達(dá)與PXR有關(guān)。
　　2.利福平對(duì)CYP3A4基因

15、啟動(dòng)子區(qū)組蛋白修飾水平及PXR、NCOA6和p300結(jié)合狀態(tài)的影響
　　通過(guò)ChIP-qPCR分析發(fā)現(xiàn)，利福平誘導(dǎo)LS174T細(xì)胞中CYP3A4表達(dá)的同時(shí)改變了CYP3A4基因啟動(dòng)子區(qū)的組蛋白修飾狀態(tài)。與對(duì)照組(0.1％ v/v，DMSO)比，利福平(10μM)使CYP3A4啟動(dòng)子序列上PXR結(jié)合區(qū)域的組蛋白H3K4me3和H3乙?；斤@著升高(P＜0.05)而使H3K27me3水平顯著降低(P＜0.05)，這種改變與CYP3A

16、4表達(dá)的上調(diào)相一致。結(jié)果提示，組蛋白甲基化和乙?；降母淖兣cCYP3A4的誘導(dǎo)表達(dá)有關(guān)。進(jìn)一步分析PXR、NCOA6和p300在CYP3A4基因啟動(dòng)子PXR結(jié)合區(qū)域的富集水平發(fā)現(xiàn)，利福平能夠顯著提高PXR結(jié)合區(qū)域NCOA6和p300的結(jié)合（上調(diào)＞1.5倍，P＜0.05），這進(jìn)一步提示組蛋白甲基化和乙酰化狀態(tài)的變化參與了利福平對(duì)CYP3A4的誘導(dǎo)作用。
　　3.干擾NCOA6和p300的表達(dá)對(duì)利福平誘導(dǎo)CYP3A4表達(dá)及組蛋白修飾

17、狀態(tài)的影響
　　通過(guò)RNA干擾實(shí)驗(yàn)將LS174T細(xì)胞中NCOA6和p300的表達(dá)抑制，發(fā)現(xiàn)CYP3A4 mRNA的基礎(chǔ)表達(dá)顯著的下調(diào)（分別下調(diào)65％、31％，P＜0.05），而利福平對(duì)CYP3A4的誘導(dǎo)作用也被顯著下調(diào)（下調(diào)＞70％，P＜0.05）。將NCOA6和p300的表達(dá)抑制后，CYP3A4啟動(dòng)子PXR結(jié)合區(qū)域的H3K4me3和H3乙?；斤@著降低(P＜0.05)而H3K27me3則明顯升高(P＜0.05)，同時(shí)利福平對(duì)C

18、YP3A4啟動(dòng)子區(qū)H3K4me3、H3K27me3和H3乙?；降母淖円脖幻黠@抑制。這表明，利福平對(duì)CYP3A4的誘導(dǎo)作用以及組蛋白修飾狀態(tài)依賴于NCOA6和p300的作用。
　　4.利福平通過(guò)激活PXR而改變CYP3A4啟動(dòng)子區(qū)的組蛋白修飾及NCOA6和p300的結(jié)合狀態(tài)
　　通過(guò)RNA干擾實(shí)驗(yàn)抑制PXR的表達(dá)后，利福平對(duì)CYP3A4啟動(dòng)子區(qū)H3K4me3、H3K27me3和H3乙?；降挠绊懕幻黠@抑制，H3K4me3

19、和H3乙?；捷^對(duì)照組明顯下降(p＜0.05)，而H3K27me3水平則顯著升高(P＜0.05)。此外，NCOA6和p300在CYP3A4啟動(dòng)子區(qū)的富集也被明顯抑制（下調(diào)＞50％，P＜0.05）。這些結(jié)果提示，PXR在利福平引起CYP3A4啟動(dòng)子區(qū)組蛋白修飾狀態(tài)變化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。進(jìn)一步通過(guò)Co-IP分析發(fā)現(xiàn)，PXR能夠與NCOA6和p300發(fā)生蛋白質(zhì)相互作用，且利福平能夠促進(jìn)這種相互作用。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，利福平促進(jìn)PXR、NC

20、OA6和p300在細(xì)胞核內(nèi)的分布，PXR在細(xì)胞核內(nèi)與NCOA6、p300的共定位明顯高于對(duì)照組。以上結(jié)果提示，利福平通過(guò)激活PXR并募集NCOA6和p300在CYP3A4基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合從而促進(jìn)CYP3A4的轉(zhuǎn)錄。
　?。ǘ﹎iRNA在利福平誘導(dǎo)CYP3A4表達(dá)中的作用及機(jī)制
　　1.利福平誘導(dǎo)CYP3A4表達(dá)對(duì)miRNA表達(dá)譜的影響
　　利福平（10μM）能夠使HepaRG細(xì)胞中CYP3A4 mRNA的表達(dá)上調(diào)3

21、0倍（vs DMSO對(duì)照組，P＜0.05），并且改變了65個(gè)miRNA的表達(dá)（＞2倍），其中47個(gè)miRNA的表達(dá)被下調(diào)，18個(gè)miRNA的表達(dá)被上調(diào)。
　　2.生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析miRNA的靶基因
　　生物信息學(xué)預(yù)測(cè)出9個(gè)miRNA能夠直接靶向CYP3A4的3'-UTR，進(jìn)一步通過(guò)qPCR檢測(cè)其表達(dá)水平，結(jié)果顯示其中7個(gè)miRNA的表達(dá)被利福平顯著下調(diào):miR-641、miR-628-3p、miR-342-5p、miR-2

22、392、miR-4289、miR-4461、 miR-766-5p（＞2倍，P＜0.05）。這提示，miRNA表達(dá)的下調(diào)可能與利福平誘導(dǎo)CYP3A4的表達(dá)有關(guān)。
　　3.miRNA對(duì)CYP3A4報(bào)告基因熒光素酶活性的影響
　　通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)miR-628-3p和miR-641能顯著降低CYP3A43'-UTR報(bào)告基因的熒光素酶活性（分別下調(diào)50％和48％，P＜0.05），而miR-766-5p和miR-342-

23、5p則不影響其活性(P＞0.05)。將CYP3A4的3'-UTR相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)突變后，miR-641和miR-628-3p對(duì)熒光素酶活性的下調(diào)作用被明顯抑制。這提示，miR-628-3p和miR-641通過(guò)靶向結(jié)合CYP3A4的3'-UTR而發(fā)揮對(duì)CYP3A4表達(dá)的下調(diào)作用。
　　4.過(guò)表達(dá)miR-628-3p和miR-641對(duì)CYP3A4的基礎(chǔ)和誘導(dǎo)表達(dá)的影響
　　在HepaRG細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-628-3p、miR-64

24、1的mimics后，CYP3A4的mRNA表達(dá)受到明顯的下調(diào)（分別為38％和55％，P＜0.05），且利福平對(duì)CYP3A4的誘導(dǎo)效應(yīng)也被明顯降低（分別為27％和35％，P＜0.05）。這些結(jié)果表明，miR-628-3p和miR-641能夠下調(diào)CYP3A4的基礎(chǔ)表達(dá)和利福平的誘導(dǎo)表達(dá)。
　?。ㄈ┤烁闻K組織中組蛋白修飾和miRNA表達(dá)與CYP3A4基礎(chǔ)表達(dá)的相關(guān)性
　　1.人肝臟樣本中CYP3A4 mRNA和蛋白的表達(dá)水平

25、r>　　CYP3A4的mRNA和蛋白表達(dá)存在顯著的個(gè)體差異，mRNA的表達(dá)水平（相對(duì)于GAPDH基因mRNA表達(dá)）為0.06～2.59（中位數(shù)0.72），最大差異43倍;蛋白的表達(dá)水平（相對(duì)于GAPDH蛋白表達(dá)）為0.10～2.33(中位數(shù)0.49)，最大差異23倍而CYP3A4基因mRNA和蛋白表達(dá)水平的相關(guān)系數(shù)為r=0.16，相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，n=18)。
　　2.肝臟中H3K4me3、H3K27me3和H3a

26、c水平與CYP3A4 mRNA表達(dá)的相關(guān)性
　　CYP3A4基因啟動(dòng)子區(qū)H3K4me3、H3K27me3和H3ac水平在10例肝臟組織樣本中也存在顯著的個(gè)體差異。相關(guān)性分析結(jié)果表明，CYP3A4的mRNA表達(dá)與近端PXR結(jié)合區(qū)域(-263～-108 bp)H3K4me3水平呈正相關(guān)(r=0.574，P＜0.05，n=10)，而與遠(yuǎn)端（-8015～7793 bp）H3K4me3水平有正相關(guān)趨勢(shì)(r=0.597，P=0.068，n=1

27、0);遠(yuǎn)端PXR結(jié)合區(qū)域(-8015～-7793 bp)的H3K27me3水平與CYP3A4的mRNA表達(dá)負(fù)相關(guān)(r=-0.638，P＜0.05, n=10);H3ac水平與CYP3A4的mRNA表達(dá)的相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，n=10)。該結(jié)果表明，H3K4me3和H3K27me3修飾與CYP3A4的轉(zhuǎn)錄水平有關(guān)。
　　3.肝臟中miR-641和miR-628-3p的表達(dá)與CYP3A4表達(dá)的相關(guān)性
　　miR-64

28、1和miR-628-3p在肝臟組織中的表達(dá)與CYP3A4表達(dá)均有相關(guān)性。其中，miR-641的表達(dá)與CYP3A4的蛋白表達(dá)負(fù)相關(guān)（r=-0.525，P＜0.05，n=18）;而miR-628-3p的表達(dá)與CYP3A4的mRNA表達(dá)負(fù)相關(guān)（r=-0.502，P＜0.05，n=10）。該結(jié)果表明，miR-641和miR-628-3p與CYP3A4的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控有關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.利福平誘導(dǎo)CYP3A4的表達(dá)與其基因啟動(dòng)子區(qū)

29、的組蛋白修飾狀態(tài)有關(guān)，通過(guò)激活核受體PXR并進(jìn)一步募集輔激活因子NCOA6和p300而調(diào)控CYP3A4基因啟動(dòng)子區(qū)的組蛋白修飾水平，從而誘導(dǎo)CYP3A4的表達(dá)。
　　2.利福平通過(guò)抑制HepaRG細(xì)胞中miR-628-3p和miR-641的表達(dá)而上調(diào)CYP3A4表達(dá)。
　　3.人肝臟中CYP3A4的mRNA表達(dá)水平與其基因啟動(dòng)子區(qū)的H3K4me3和H3K27me3修飾水平顯著相關(guān)。miR-641和miR-628-3p在肝臟中