青蒿素類藥物對孕烷X受體和組成型雄烷受體介導的CYP3A4和CYP2B6轉錄調節(jié)作用.pdf

1、[研究背景]：
　　 青蒿素類抗瘧藥是一類具有內過氧橋結構的倍半萜內酯類化合物。已有研究表明青蒿素(ART)口服吸收迅速但不完全，多劑量口服給藥后的血藥濃度-時間曲線下面積明顯降低，具有自身誘導代謝現象。而該類藥物的半衰期并沒有隨著血藥濃度的下降而改變，所以推測該類藥物的自身誘導代謝很可能是通過首過消除機制產生的。青蒿素類藥物自身誘導代謝現象主要與CYP286有關，在該酶缺乏的情況下，CYP3A4也起次要代謝作用，且該類藥物還能

2、誘導CYP2C19。鑒于目前青蒿素類抗瘧藥臨床以聯(lián)合用藥為主，且這類藥物存在對CYP450的誘導作用，因此易發(fā)生藥物間相互作用。這種自身誘導代謝不但會降低該類藥物的治療效果，還可能影響到與其聯(lián)合應用的藥物代謝水平。青蒿素及其聯(lián)合使用的藥物被清除代謝的程度大小取決于青蒿素類藥物對藥物代謝酶誘導作用的強弱以及藥物的治療窗范圍。
　　 孕烷X受體(HumanpregnaneX。receptor,hPXR)和組成型雄烷受體(Humanc

3、onstitutiveandrostanereceptor，hCAR)是CYP3A4和CYP286基因轉錄調節(jié)的關鍵因子。當外源性化合物進入細胞后，與細胞核內PXR受體的LBD區(qū)域結合，然后再與RXR結合形成異源二聚體，從而與CYP3A4基因反應元件相結合，啟動基因的轉錄表達。利用在此分子機制上建立起來的hPXR和hCAR介導的CYP3A4和CYP286基因轉錄調節(jié)系統(tǒng)，可以了解外源性化合物對CYP3A4和CYP286的誘導作用機制，預

4、測藥物之間的相互作用，減輕或避免由此產生的不良影響。
　　 已有動物和人體實驗證明，青蒿素類藥物主要經過肝臟的攝取被清除，且該類藥物在腸上皮細胞和肝細胞中具有較高的濃度，而上述兩個生理部位也恰是核受體hPXR和hCAR高表達部位，因此推測核受體hPXR和hCAR很可能是介導青蒿素類藥物誘導CYP3A4和CYP286基因轉錄調節(jié)的關鍵因子，從而可在基因水平闡釋該類藥物的自身誘導代謝機理。青蒿素類藥物是否通過激活孕烷X受體或者組成型

5、雄烷受體而發(fā)揮對CYP450的誘導作用，目前尚不清楚。本文選擇該類藥物的母體化合物青蒿素和該類藥物衍生物的共有活性代謝物雙氫青蒿素(DHA)為模型藥物，考察其對CYP3A4和CYP286的轉錄調節(jié)作用。闡明其自身誘導機制對優(yōu)化該類藥物結構，豐富其自身誘導代謝機理，指導臨床合理用藥，減少不良反應有著重要意義。
　　 [目的]：探討ART和DHA是否能通過激活核受體hPXR或hCAR對CYP3A4和CYP286產生轉錄調節(jié)作用。

6、r>　　 [方法]：
　　 1.建立雙報告基因檢測體系，并通過已知的陽性藥物確證該體系的可靠性；在此基礎上，優(yōu)化hPXR和hCAR介導的CPY3A4和CYP286轉錄誘導轉染體系，提高檢測系統(tǒng)的靈敏度。利用invitrogen脂質體2000共同轉染表達質粒hPXR/hCAR，報告基因質粒CYP3A4/CYP286和內參質粒pRL-TK于HepG-2細胞中。以hPXR的激動劑利福平，hCAR的激動劑CITCO為陽性對照組，以O.

7、1％DMSO為溶劑對照組；通過調整三種質粒的轉染比例，以RIF/DMSO和CITCO/DMSO的比活值，即陽性藥物的誘導倍數作為優(yōu)化系統(tǒng)靈敏度的指標，分別獲得最大比值以表示系統(tǒng)具有最佳靈敏度。
　　 2.通過MTT實驗確定青蒿素和雙氫青蒿素的藥物干預濃度，選擇小于IC50的藥物濃度作為ART和DHA干預HepG-2細胞的測試濃度。
　　 3.采用報告基因瞬時共轉染的方法，分別以青蒿素（2、5、10、30、50、70μmo

8、l/L）和雙氫青蒿素（1、3、5、10、15、20μmol/L）的濃度來干預己轉染三種質粒的HepG-2細胞24小時，考察不同濃度藥物對CPY3A4和CYP286的誘導作用即濃度效應。對于有誘導作用的藥物濃度，分別干預細胞24h、48h、72h以考察藥物誘導作用的時間效應。
　　 4.通過裂解藥物干預的細胞，釋放出細胞編碼的螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶，用雙螢光素酶檢測試劑盒分別檢測他們的活性值。用每孔測得的螢火蟲螢光素值/同孔

9、的海腎螢光素酶活性值得到該孔的校正值。用藥物干預組每孔的校正值/DMSO孔校正值均值得到每孔的比活值，即藥物組相對于DMSO組的誘導倍數。每組實驗平行轉染2次，每次設置3個復孔。采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件分析數據，以均數土標準差的形式表示誘導倍數。
　　 [結果]：
　　 1.建立了hPXR和hCAR介導的CPY3A4和CYP286藥物誘導體外篩選體系，并通過優(yōu)化轉染體系提高了系統(tǒng)的靈敏度，且最終確定三種質粒的轉染比例

10、為pCDNA-hPXR/hCAR150ng∶pGL-CPY3A4/CYP28600ng∶pRL-TK50ng（共800ng）。
　　 2.通過MTT實驗確定了青蒿素的藥物干預濃度為2、5、10、30、50、70μmol/L，雙氫青蒿素的藥物干預濃度為1、3、5、10、15、20μmol/L。
　　 3.在考察青蒿素和雙氫青蒿素通過hPXR介導的CYP3A4和CYP286轉錄調節(jié)實驗中發(fā)現，青蒿素2、5、10、30、50、

11、70μmol/L和雙氫青蒿素1、3、5、10、15、20μmol/L等不同濃度干預HepG-2細胞24小時后，與0.1％DMSO溶劑對照組相比較均未產生明顯的誘導作用(P＞0.05)，而陽性組利福平的誘導倍數均在4倍左右（(P＜0.001)）。
　　 4.在考察青蒿素和雙氫青蒿素通過hCAR介導的CYP3A4轉錄調節(jié)實驗中發(fā)現，青蒿素在5、10μmol/L兩個濃度可以通過激活hCAR受體對CYP3A4轉錄產生誘導作用，其誘導倍數

12、分別為3.65±0.28(P＜0.01)和3.42±0.16（P＜0.01）。雙氫青蒿素在1、3、5μmol/L三個低濃度可以通過激活hCAR受體對CYP3A4轉錄產生誘導作用，其誘導倍數分別為2.78±0.26(P＜0.05),2.89±0.32(P＜0.05),3.14±0.27(P＜0.01).
　　 5．在考察青蒿素和雙氫青蒿素通過hCAR介導的CYP286轉錄調節(jié)實驗中發(fā)現，青蒿素在2、5、10、30μmol/L四個濃

13、度可以通過激活hCAR受體對CYP286轉錄產生誘導作用，其誘導倍數分別為3.37±0.24(P＜0.01),3.14±0.31(P＜0.01),3.27±0.29(P＜0.01)，2.96±0.18(P＜0.05)。雙氫青蒿素在1、3、5、10、15、20μmol/L六個濃度均可以通過激活hCAR受體對CYP3A轉錄產生誘導作用，其誘導倍數分別為3.24±0.21（P＜0.01）,3.37±0.29(P＜0.01),3.12±0.31

14、(P＜0.01),3.08±0.19(P＜0.01),2.98±0.22(P＜0.05),2.76±0.23(P＜0.05)。
　　 6．在考察具有誘導作用的青蒿素10μmol/L和雙氫青蒿素5μmol/L的濃度時間依賴性實驗中發(fā)現，二者的誘導作用均在48h具有最大值，青蒿素10μmol幾通過hCAR介導，對CYP286和CYP3A4的最大誘導倍數分別為3.89±0.23(P＜0.01)和3.97±0.35（P±0.01）。雙氫

15、青蒿素5μmol幾通過hCAR介導，對CYP286和CYP3A4的最大誘導倍數分別為4.12±0.35（P＜0.001）和3.94±0.31(P＜O.01)。
　　 [結論]：
　　 1.青蒿素和雙氫青蒿素在測試濃度范圍內未發(fā)現可以激活hPXR受體而誘導CYP3A4和CYP286的轉錄。
　　 2.青蒿素和雙氫青蒿素在不同的測試濃度范圍內均可以通過hCAR受體對CYP3A4和CYP286的轉錄產生誘導作用，并且存