阻滯NRF2后砷對(duì)NRF2抑制因子的影響及與MAPK基因關(guān)系.pdf

1、目的：NRF2基因抑制的人角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞為模型細(xì)胞，阻滯NRF2對(duì)NRF2抑制因子的影響及與MAPK基因關(guān)系，為砷致皮膚毒性機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　方法：1、NRF2 shRNA的構(gòu)建：以人源NRF2基因?yàn)榘谢?，設(shè)計(jì)與NRF2基因具有特異性的小干擾RNA，構(gòu)建其shRNA，重組慢病毒表達(dá)載體，并進(jìn)行測(cè)序鑒定。2、慢病毒包裝：用重組后表達(dá)成功的載體轉(zhuǎn)染并包裝細(xì)胞293T，收集、濃縮病毒上清液、測(cè)定其滴度。3、抑制NR

2、F2基因的Hacat細(xì)胞模型的構(gòu)建，構(gòu)建好的三種慢病毒分別感染HaCaT細(xì)胞（MOI=5）,感染48小時(shí)后，用1μg/ml的嘌呤霉素篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。4、穩(wěn)定細(xì)胞株的鑒定：篩選出穩(wěn)定的細(xì)胞株后，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-Time Quantitative PCR)檢測(cè)干擾效率。5、細(xì)胞培養(yǎng)與砷處理：所用細(xì)胞均按細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)。6、MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長狀況，確定砷處理濃度，砷處理濃度別為以毒理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的LC50的1/100、1

3、/50、1/10。7、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞活性氧。8、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中Nrf2、KEAP1、N6AMT1、Bach1、MAPK/ERK mRNA的表達(dá)水平。9、ELISA法檢測(cè)細(xì)胞中GSH、N6AMT1、COX-2的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1、慢病毒干擾載體構(gòu)建測(cè)序結(jié)果顯示重組載體構(gòu)建成功。2、慢病毒滴度測(cè)試結(jié)果：依據(jù)滴度（TU/ml）=細(xì)胞數(shù)×百分比×MOI(1)×病毒稀釋倍數(shù)×103選取最佳滴度的病毒。3、選取NR

4、F2 shRNA3 Hacat細(xì)胞，其基因的抑制效率為87％。4、砷處理低、中、高劑量組分別為2.10μmol/L、4.20μmol/L、21.00μmol/L，抑制Nrf2、抑制Keap1、空白對(duì)照組砷處理濃度為0μmol/L。5、細(xì)胞增殖：2.10μmol/L砷處理細(xì)胞，細(xì)胞出現(xiàn)增殖現(xiàn)象；4.20μmol/L砷處理細(xì)胞在72h開始出抑制；21.00μmol/L砷處理細(xì)胞48h開始明顯抑制細(xì)胞?？瞻捉M細(xì)胞增值率略低于抑制Keap1對(duì)照

5、組，高于抑制Nrf2對(duì)照組。6、活性氧（ROS）在空白組表達(dá)較高隨時(shí)間變化趨向穩(wěn)定，抑制Keap1基因ROS表達(dá)上調(diào)，抑制Nrf2基因ROS降低，砷處理后ROS下調(diào)。7、2.10μmol/L、4.2μmol/L砷處理抑制Nrf2基因的細(xì)胞8h、24h后促進(jìn)Bach1、N6AMT1、MAPK/ERK mRNA的表達(dá)；21.00μmol/L砷處理72h可使抑制Nrf2基因的細(xì)胞中Bach1、N6AMT1、MAPK/ERK mRNA表達(dá)下調(diào)，

6、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。8、2.10μmol/L、24h砷處理的抑制NRF2基因的HaCaT細(xì)胞能使N6AMT1、COX-2、GSH蛋白的表達(dá)上調(diào)；72h、29.00μmol/L砷處理抑制NRF2基因的HaCaT細(xì)胞使N6AMT1、COX-2、GSH蛋白的表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；
　　結(jié)論：1、砷具有低促效應(yīng)。2、N6AMT1能夠調(diào)控氧化與抗氧化水平。3、GSH調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化水平。4、ROS在體內(nèi)有維