硼對雛鴕鳥腎抗氧化能力及Nrf2信號通路的影響.pdf

1、鴕鳥具有豐厚的經(jīng)濟(jì)價值和寶貴的科研價值，近年來鴕鳥產(chǎn)業(yè)也在世界上逐漸壯大和發(fā)展。硼參與動物機(jī)體多種代謝活動，與生長性能和免疫功能密切相關(guān)。大量的研究報道，低劑量的硼對機(jī)體生長發(fā)育具有促進(jìn)和營養(yǎng)作用，是動物所必需的一種微量元素，而高劑量的硼則具有一定的抑制甚至毒害作用。硼營養(yǎng)作用的發(fā)揮可能與硼的抗氧化作用相關(guān)。此外，腎組織作為硼重要的排泄器官和蓄積器官，更容易受到外界因素的刺激。因此，本試驗以90日齡雛鴕鳥腎組織作為試驗材料，通過硼酸的形

2、式分別在飲水中添加0，40，80，160，320和640 mg/L硼，分別采用HE、免疫組織化學(xué)、TUNEL技術(shù)、MDA、GSH-Px和T-AOC測定和實時熒光定量PCR方法，研究添加硼對雛鴕鳥腎抗氧化能力和Nrf2介導(dǎo)的抗氧化防御信號通路的影響，以此探明硼對雛鴕鳥腎抗氧化能力的作用機(jī)制。研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.硼對雛鴕鳥腎組織結(jié)構(gòu)的影響
　　與對照組相比較，40、80 mg/L硼組腎組織結(jié)構(gòu)更清晰，腎小管上皮細(xì)胞分界

3、更明顯;160 mg/L硼組腎組織除少數(shù)腎小球毛細(xì)血管輕微擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞有輕微的脂肪變性外，未見明顯的組織結(jié)構(gòu)改變;320、640 mg/L組腎小體結(jié)構(gòu)模糊，腎小管不同程度的損傷，尤其是近端小管，此外，上皮細(xì)胞碎裂或消失，管腔內(nèi)散布大量的組織碎片。
　　2.硼對雛鴕鳥腎組織細(xì)胞凋亡的影響
　　細(xì)胞凋亡貫穿細(xì)胞生長發(fā)育的整個過程，特別是受到外界刺激時，細(xì)胞凋亡更易發(fā)生。雛鴕鳥腎組織的HE染色切片結(jié)果顯示，添加160～64

4、0 mg/L硼組腎小管上皮細(xì)胞體積明顯縮小，細(xì)胞核碎裂和固縮，提示可能發(fā)生細(xì)胞凋亡。為了驗證此點，本試驗采用TUNEL技術(shù)結(jié)合IPP軟件進(jìn)行研究和統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，40，80 mg/L硼組凋亡細(xì)胞在雛鴕鳥的腎小球和腎間質(zhì)以及腎小管均有分布，但凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少，提示40，80 mg/L硼能夠顯著抑制雛鴕鳥腎組織細(xì)胞凋亡;160 mg/L硼組凋亡細(xì)胞數(shù)量稍微增加;320、640mg/L硼組雛鴕鳥腎組織凋亡細(xì)胞主要分布于

5、雛鴕鳥的腎小管上皮細(xì)胞中，而且凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著增加，以640 mg/L硼組最為顯著，提示320、640 mg/L硼顯著促進(jìn)雛鴕鳥腎組織發(fā)生細(xì)胞凋亡。
　　3.硼對雛鴕鳥腎組織抗氧化能力的影響
　　本試驗使用MDA、GSH-Px和T-AOC試劑盒分別測定雛鴕鳥腎組織MDA含量、GSH-Px和T-AOC酶活性。數(shù)據(jù)顯示:與對照組比較，飲水中添加40、80 mg/L硼（以80 mg/L硼最顯著），明顯提高雛鴕鳥腎組織GSH-Px和

6、T-AOC酶活性，降低MDA含量，進(jìn)而提高雛鴕鳥腎組織的抗氧化能力;飲水中添加160 mg/L及以上硼（特別是640 mg/L硼），顯著降低雛鴕鳥腎組織T-AOC酶活性，同時顯著升高M(jìn)DA含量，提示雛鴕鳥腎組織抗氧化能力降低，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)，可能造成腎組織的氧化損傷。
　　4.硼對雛鴕鳥腎組織Nrf2信號通路的作用研究
　　Nrf2信號通路是機(jī)體抵抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵保護(hù)通路，能夠維持機(jī)體細(xì)胞氧化還原反應(yīng)的動態(tài)平衡，同時還具

7、有抑制細(xì)胞凋亡的作用。本研究利用熒光定量PCR技術(shù)檢測雛鴕鳥腎組織中Nrf2信號通路里的3個主要基因(Nrf2、HO-1和GCLc)的表達(dá)。結(jié)果顯示，添加40、80 mg/L硼3種基因的表達(dá)呈上升水平，且明顯高于對照組，提示40、80 mg/L硼可能提高抗氧化能力基線;添加320、640 mg/L硼Nrf2、HO-1和GCLc基因的表達(dá)水平逐漸下降，但與對照組相比，表達(dá)量仍然顯著升高，提示通過激活Nrf2信號通路，增加下游HO-1和GC

8、Lc抗氧化酶的表達(dá)，應(yīng)對高硼產(chǎn)生的刺激損傷和細(xì)胞凋亡。
　　5.硼對雛鴕鳥腎組織Nrf2蛋白定位表達(dá)的研究
　　Nrf2是信號通路中的主控調(diào)節(jié)因子。本試驗采用免疫組織化學(xué)技術(shù)對Nrf2蛋白表達(dá)進(jìn)行定位的研究。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，40和80 mg/L硼組Nrf2蛋白顆粒主要分布雛鴕鳥腎小管中，以上皮細(xì)胞數(shù)目居多。當(dāng)硼濃度超過160 mg/L，在多數(shù)雛鴕鳥腎小管上皮細(xì)胞以及個別的腎小球和腎間質(zhì)中都有Nrf2棕黃顆粒的表達(dá)，分布以聚集態(tài)

9、居多，與對照組相比，蛋白表達(dá)量明顯增多。
　　綜合以上試驗結(jié)果，得出以下試驗結(jié)論:(1)低劑量硼(40、80 mg/L)能夠提高雛鴕鳥腎組織的抗氧化能力，抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而可能促進(jìn)雛鴕鳥腎組織的發(fā)育具有作用，以80 mg/L營養(yǎng)效果最優(yōu);高劑量硼(320、640 mg/L)降低雛鴕鳥腎組織的抗氧化能力，增強(qiáng)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生，對雛鴕鳥腎組織具有一定的損傷作用，以640 mg/L最為明顯。(2)硼對雛鴕鳥腎組織抗氧化能