慢性砷暴露對(duì)小鼠肝臟損傷和NRF2信號(hào)通路的影響.pdf

1、目的：
　　砷在自然界中廣泛存在。慢性砷暴露主要以飲水砷暴露為主，可以導(dǎo)致機(jī)體多臟器如皮膚、肝臟、胃腸道、神經(jīng)系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)等的損傷，甚至可以導(dǎo)致肝癌、皮膚癌和膀胱癌。肝臟是人體重要的代謝器官，研究已經(jīng)明確，肝臟是砷毒性和致癌性的主要靶器官。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，砷可以引起肝功能異常、肝腫大、非肝硬化門脈高壓、肝纖維化和肝硬化，甚至肝癌，肝臟的纖維化損傷是慢性砷中毒的一項(xiàng)重要的形態(tài)學(xué)損傷。砷通過(guò)多種機(jī)制損傷機(jī)體的生物系統(tǒng)，其中最主要的

2、是生成活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)?；钚匝醯漠a(chǎn)生和氧化應(yīng)激可能在砷的毒性和致癌性發(fā)揮根本作用，可能由于產(chǎn)生的ROS可以導(dǎo)致基因毒性，會(huì)改變信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，抑制DNA修復(fù)，并增加細(xì)胞增殖。砷可以消耗肝臟組織中的谷胱甘肽(glutathione，GSH)以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)等抗氧化酶，并且可以在肝臟的病理學(xué)觀察到

3、肝臟細(xì)胞的水樣變性、炎細(xì)胞浸潤(rùn)和肝細(xì)胞再生。
　　近年來(lái)，核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid2-related factor2，NRF2）及其調(diào)控的信號(hào)通路被證明可以促進(jìn)一系列保護(hù)細(xì)胞基因?qū)箼C(jī)體的氧化應(yīng)激，處于機(jī)體氧化應(yīng)激的抗氧化防御應(yīng)答機(jī)制核心地位。在急性暴露中砷可以通過(guò)激活NRF2調(diào)控Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄，包括谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase，

4、GST)、谷氨酸半胱氨酸連接酶(L-glutamate-cysteineligase，GCL)等能夠誘導(dǎo)一系列保護(hù)細(xì)胞基因的適應(yīng)性反應(yīng)可以保護(hù)機(jī)體免受活性物質(zhì)（如活性氧）及一些毒性物質(zhì)（如致癌物、藥物代謝活化產(chǎn)物）等的侵害。目前對(duì)于慢性砷暴露整體動(dòng)物模型對(duì)肝臟影響的研究多集中在病理和生化水平，對(duì)NRF2信號(hào)通路在無(wú)機(jī)砷所致肝臟損傷中的作用還有待研究。
　　綜上所述，本研究擬采用整體動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)，觀察慢性砷暴露小鼠的肝臟氧化應(yīng)激和炎性

5、改變，并且初步探討慢性砷暴露對(duì)機(jī)體NRF2信號(hào)通路的可能影響，為進(jìn)一步探索無(wú)機(jī)砷引發(fā)肝臟損傷的可能機(jī)制等提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組:
　　健康昆明種雌性小鼠120只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將小鼠按體重隨機(jī)按數(shù)字表分組。采用NaAsO2自由飲水喂飼方式染毒，染毒濃度分別為0mg/L、25mg/L、50mg/L和100mg/L NaAsO2水溶液，染毒時(shí)間分別為1個(gè)月、3個(gè)月和12個(gè)月，共計(jì)12組，每組

6、10只。染毒期間各組小鼠均喂養(yǎng)普通飼料。
　　2、檢測(cè)指標(biāo)與方法:
　　(1)肝臟砷含量測(cè)定:高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光測(cè)定法
　　(2)肝臟病理形態(tài)觀察:HE染色
　　(3)肝臟功能性檢測(cè):采用南京建成公司試劑盒測(cè)定血清ALT和AST活力
　　(4)肝臟氧化應(yīng)激檢測(cè):采用南京建成公司試劑盒測(cè)定肝臟MDA含量、肝臟SOD活力、肝臟CAT活力、肝臟GSH-Px活力
　　(5)肝臟炎性損傷檢測(cè):采

7、用南京建成公司試劑盒測(cè)定肝臟MPO活力、采用Real Time PCR法檢測(cè)肝臟Il-1β、Il-6和Tnf-α基因的mRNA表達(dá)水平
　　(6)肝臟NRF2及其下游調(diào)控蛋白表達(dá)水平:采用western blot方法
　　結(jié)果：
　　1、慢性砷暴露小鼠一般情況
　　小鼠自由飲用含砷水12個(gè)月，小鼠生長(zhǎng)狀況良好。染毒終點(diǎn)解剖時(shí)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的病變。NaAsO2染毒組與Control組狀況沒(méi)有明顯差異。隨著染毒時(shí)間的增

8、加，12個(gè)月的各組的體重增量逐漸升高。染毒終點(diǎn)時(shí)，染毒組體重增量低于Control組。除了12個(gè)月的100mg/L NaAsO2染毒組肝臟重量和臟器系數(shù)隨著染毒劑量的增加而略有升高外，其余各組染毒組隨著染毒劑量的增加，肝臟重量和臟器系數(shù)明顯降低，差異具有顯著性(p＜0.05)。
　　2、慢性砷暴露小鼠的肝臟損傷情況
　　(1)慢性砷暴露小鼠的肝臟病理學(xué)改變
　　Control組肝小葉結(jié)構(gòu)正常和肝細(xì)胞形態(tài)正常，核膜完整，

9、細(xì)胞呈條索樣分布。1個(gè)月100mg/L NaAsO2染毒組肝索明顯，有輕微空泡樣變性;3個(gè)月100mg/LNaAsO2染毒組肝臟細(xì)胞邊界不清，肝索結(jié)構(gòu)不清，偶可見成纖維細(xì)胞;12個(gè)月100mg/L NaAsO2染毒組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，界限不清呈現(xiàn)彌漫性，可見梭形細(xì)胞核，染色質(zhì)深染，炎細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　(2)慢性砷暴露小鼠的血清ALT和AST活力
　　與Control組相比，隨著染毒劑量的增加，染毒組血清ALT和AST活力升高，差

10、異具有顯著性(p＜0.05)。
　　(3)慢性砷暴露小鼠的肝臟氧化應(yīng)激情況
　　NaAsO2染毒組肝臟MDA含量沒(méi)有明顯變化。與Control組相比，1個(gè)月的NaAsO2染毒組SOD活力、CAT活力和GSH-Px活力均降低，3個(gè)月NaAsO2染毒組GSH-Px活力降低，而50 mg/L和100 mg/L NaAsO2染毒組CAT活力升高，12個(gè)月25 mg/L和100 mg/L NaAsO2染毒組GSH-Px活力有所升高，差

11、異具有顯著性(p＜0.05)。
　　(4)慢性砷暴露小鼠的肝臟炎性因子表達(dá)水平
　　與Control組相比，1個(gè)月的25mg/L NaAsO2染毒組MPO活力升高，3個(gè)月的100mg/L NaAsO2染毒組MPO活力升高，差異具有顯著性(p＜0.05)。
　　Il-1βmRNA表達(dá)水平1個(gè)月NaAsO2染毒組有所降低，3個(gè)月NaAsO2染毒組有所升高，12個(gè)月100mg/L NaAsO2染毒組顯著性升高(p＜0.05)

12、。Il-6mRNA表達(dá)水平與Il-1βmRNA表達(dá)水平結(jié)果相似，1個(gè)月25mg/L和50mg/L NaAsO2染毒組有所降低，3個(gè)月NaAsO2染毒組有所升高，12個(gè)月25mg/L和100mg/LNaAsO2染毒組顯著性升高(p＜0.05)。Tnf-αmRNA表達(dá)水平1個(gè)月NaAsO2染毒組沒(méi)有明顯變化，3個(gè)月25mg/L NaAsO2染毒組降低而50mg/L NaAsO2染毒組有所升高，12個(gè)月50mg/L和100mg/L NaAsO

13、2染毒組顯著性升高(p＜0.05）。
　　3、慢性砷暴露對(duì)小鼠肝臟NRF2信號(hào)通路的影響
　　1、3和12個(gè)月的NaAsO2染毒組NRF2蛋白表達(dá)水平增加，NRF2所調(diào)控的Ⅱ相解毒酶GSTO1/2和GSH相關(guān)的抗氧化酶（GCLC和GCLM）的蛋白表達(dá)水平均明顯增加。
　　結(jié)論：
　　1、慢性砷暴露能夠引起小鼠肝臟器質(zhì)性和功能性改變、氧化應(yīng)激和炎性損傷。
　　2、慢性砷暴露能夠持續(xù)性激活小鼠肝臟NRF2信號(hào)通