慢性砷暴露對小鼠肝臟損傷和NRF2信號通路的影響.pdf

1、目的：
　　砷在自然界中廣泛存在。慢性砷暴露主要以飲水砷暴露為主，可以導致機體多臟器如皮膚、肝臟、胃腸道、神經(jīng)系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)等的損傷，甚至可以導致肝癌、皮膚癌和膀胱癌。肝臟是人體重要的代謝器官，研究已經(jīng)明確，肝臟是砷毒性和致癌性的主要靶器官。流行病學研究發(fā)現(xiàn)，砷可以引起肝功能異常、肝腫大、非肝硬化門脈高壓、肝纖維化和肝硬化，甚至肝癌，肝臟的纖維化損傷是慢性砷中毒的一項重要的形態(tài)學損傷。砷通過多種機制損傷機體的生物系統(tǒng)，其中最主要的

2、是生成活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)?；钚匝醯漠a(chǎn)生和氧化應激可能在砷的毒性和致癌性發(fā)揮根本作用，可能由于產(chǎn)生的ROS可以導致基因毒性，會改變信號轉(zhuǎn)導途徑，抑制DNA修復，并增加細胞增殖。砷可以消耗肝臟組織中的谷胱甘肽(glutathione，GSH)以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和過氧化氫酶(catalase，CAT)等抗氧化酶，并且可以在肝臟的病理學觀察到

3、肝臟細胞的水樣變性、炎細胞浸潤和肝細胞再生。
　　近年來，核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid2-related factor2，NRF2）及其調(diào)控的信號通路被證明可以促進一系列保護細胞基因?qū)箼C體的氧化應激，處于機體氧化應激的抗氧化防御應答機制核心地位。在急性暴露中砷可以通過激活NRF2調(diào)控Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄，包括谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase，

4、GST)、谷氨酸半胱氨酸連接酶(L-glutamate-cysteineligase，GCL)等能夠誘導一系列保護細胞基因的適應性反應可以保護機體免受活性物質(zhì)（如活性氧）及一些毒性物質(zhì)（如致癌物、藥物代謝活化產(chǎn)物）等的侵害。目前對于慢性砷暴露整體動物模型對肝臟影響的研究多集中在病理和生化水平，對NRF2信號通路在無機砷所致肝臟損傷中的作用還有待研究。
　　綜上所述，本研究擬采用整體動物學實驗，觀察慢性砷暴露小鼠的肝臟氧化應激和炎性

5、改變，并且初步探討慢性砷暴露對機體NRF2信號通路的可能影響，為進一步探索無機砷引發(fā)肝臟損傷的可能機制等提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1、實驗動物與分組:
　　健康昆明種雌性小鼠120只，適應性飼養(yǎng)1周后，將小鼠按體重隨機按數(shù)字表分組。采用NaAsO2自由飲水喂飼方式染毒，染毒濃度分別為0mg/L、25mg/L、50mg/L和100mg/L NaAsO2水溶液，染毒時間分別為1個月、3個月和12個月，共計12組，每組

6、10只。染毒期間各組小鼠均喂養(yǎng)普通飼料。
　　2、檢測指標與方法:
　　(1)肝臟砷含量測定:高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光測定法
　　(2)肝臟病理形態(tài)觀察:HE染色
　　(3)肝臟功能性檢測:采用南京建成公司試劑盒測定血清ALT和AST活力
　　(4)肝臟氧化應激檢測:采用南京建成公司試劑盒測定肝臟MDA含量、肝臟SOD活力、肝臟CAT活力、肝臟GSH-Px活力
　　(5)肝臟炎性損傷檢測:采

7、用南京建成公司試劑盒測定肝臟MPO活力、采用Real Time PCR法檢測肝臟Il-1β、Il-6和Tnf-α基因的mRNA表達水平
　　(6)肝臟NRF2及其下游調(diào)控蛋白表達水平:采用western blot方法
　　結(jié)果：
　　1、慢性砷暴露小鼠一般情況
　　小鼠自由飲用含砷水12個月，小鼠生長狀況良好。染毒終點解剖時沒有發(fā)現(xiàn)明顯的病變。NaAsO2染毒組與Control組狀況沒有明顯差異。隨著染毒時間的增

8、加，12個月的各組的體重增量逐漸升高。染毒終點時，染毒組體重增量低于Control組。除了12個月的100mg/L NaAsO2染毒組肝臟重量和臟器系數(shù)隨著染毒劑量的增加而略有升高外，其余各組染毒組隨著染毒劑量的增加，肝臟重量和臟器系數(shù)明顯降低，差異具有顯著性(p＜0.05)。
　　2、慢性砷暴露小鼠的肝臟損傷情況
　　(1)慢性砷暴露小鼠的肝臟病理學改變
　　Control組肝小葉結(jié)構(gòu)正常和肝細胞形態(tài)正常，核膜完整，

9、細胞呈條索樣分布。1個月100mg/L NaAsO2染毒組肝索明顯，有輕微空泡樣變性;3個月100mg/LNaAsO2染毒組肝臟細胞邊界不清，肝索結(jié)構(gòu)不清，偶可見成纖維細胞;12個月100mg/L NaAsO2染毒組肝細胞結(jié)構(gòu)消失，界限不清呈現(xiàn)彌漫性，可見梭形細胞核，染色質(zhì)深染，炎細胞浸潤。
　　(2)慢性砷暴露小鼠的血清ALT和AST活力
　　與Control組相比，隨著染毒劑量的增加，染毒組血清ALT和AST活力升高，差

10、異具有顯著性(p＜0.05)。
　　(3)慢性砷暴露小鼠的肝臟氧化應激情況
　　NaAsO2染毒組肝臟MDA含量沒有明顯變化。與Control組相比，1個月的NaAsO2染毒組SOD活力、CAT活力和GSH-Px活力均降低，3個月NaAsO2染毒組GSH-Px活力降低，而50 mg/L和100 mg/L NaAsO2染毒組CAT活力升高，12個月25 mg/L和100 mg/L NaAsO2染毒組GSH-Px活力有所升高，差

11、異具有顯著性(p＜0.05)。
　　(4)慢性砷暴露小鼠的肝臟炎性因子表達水平
　　與Control組相比，1個月的25mg/L NaAsO2染毒組MPO活力升高，3個月的100mg/L NaAsO2染毒組MPO活力升高，差異具有顯著性(p＜0.05)。
　　Il-1βmRNA表達水平1個月NaAsO2染毒組有所降低，3個月NaAsO2染毒組有所升高，12個月100mg/L NaAsO2染毒組顯著性升高(p＜0.05)

12、。Il-6mRNA表達水平與Il-1βmRNA表達水平結(jié)果相似，1個月25mg/L和50mg/L NaAsO2染毒組有所降低，3個月NaAsO2染毒組有所升高，12個月25mg/L和100mg/LNaAsO2染毒組顯著性升高(p＜0.05)。Tnf-αmRNA表達水平1個月NaAsO2染毒組沒有明顯變化，3個月25mg/L NaAsO2染毒組降低而50mg/L NaAsO2染毒組有所升高，12個月50mg/L和100mg/L NaAsO

13、2染毒組顯著性升高(p＜0.05）。
　　3、慢性砷暴露對小鼠肝臟NRF2信號通路的影響
　　1、3和12個月的NaAsO2染毒組NRF2蛋白表達水平增加，NRF2所調(diào)控的Ⅱ相解毒酶GSTO1/2和GSH相關(guān)的抗氧化酶（GCLC和GCLM）的蛋白表達水平均明顯增加。
　　結(jié)論：
　　1、慢性砷暴露能夠引起小鼠肝臟器質(zhì)性和功能性改變、氧化應激和炎性損傷。
　　2、慢性砷暴露能夠持續(xù)性激活小鼠肝臟NRF2信號通