家蠅Keap1和Nrf2基因的克隆、表達(dá)及功能分析.pdf

1、家蠅以腐殖質(zhì)為食，生存環(huán)境伴隨有許多病菌的滋生，因此，家蠅擁有強(qiáng)大的免疫調(diào)控機(jī)制來(lái)抵御病菌的侵害。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室家蠅轉(zhuǎn)錄組和 NCBI公布的家蠅基因組兩大數(shù)據(jù)庫(kù)，分析核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2和其抑制劑Keap1的生物信息，這兩種蛋白在家蠅體內(nèi)大小分別為858和924個(gè)氨基酸，Keap1的理論分子量為95.75 ku，理論等電點(diǎn)為7.68，Nrf2相對(duì)分子量為113.72 ku，理論等電點(diǎn)為5.73。二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，Keap1主要具有BT

2、B和Kel ch兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，其中BTB和泛素連接酶3結(jié)合，Kelch與 Nrf2結(jié)合。Nrf2主要包含堿性亮氨酸拉鏈，用于結(jié)合特殊的DNA序列。選擇保守結(jié)構(gòu)域序列，構(gòu)建原核表達(dá)載體，用于抗體制備和Western Blot檢測(cè)。
　　本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)Keap1和Nrf2基因核酸表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)組選取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌刺激刺激后6h、12h、24h、48h、72h五個(gè)點(diǎn)的家蠅幼蟲(chóng)作定量分析，對(duì)照組為未做菌刺

3、激（0 h）的幼蟲(chóng)，結(jié)果顯示，細(xì)菌刺激后Keap1基因呈下調(diào)趨勢(shì)，Nrf2基因呈上調(diào)趨勢(shì)。在組織定量分析，Keap1在脂肪體中表達(dá)量最高，具有顯著性，在血細(xì)胞中表達(dá)量最低。Nrf2在腸道中表達(dá)量最高，在表皮中最低。用含有Keap1-dsRNA和 Nrf2-dsRNA的工程菌干擾家蠅幼蟲(chóng)，對(duì)干擾后目的基因RNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示，Keap1和Nrf2基因均被敲低，效果顯著。幼蟲(chóng)被干擾后再次菌刺激，Keap1敲低組的幼蟲(chóng)在菌刺激