家蠅Keap1和Nrf2基因的克隆、表達及功能分析.pdf

1、家蠅以腐殖質(zhì)為食，生存環(huán)境伴隨有許多病菌的滋生，因此，家蠅擁有強大的免疫調(diào)控機制來抵御病菌的侵害。根據(jù)本實驗室家蠅轉(zhuǎn)錄組和 NCBI公布的家蠅基因組兩大數(shù)據(jù)庫，分析核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2和其抑制劑Keap1的生物信息，這兩種蛋白在家蠅體內(nèi)大小分別為858和924個氨基酸，Keap1的理論分子量為95.75 ku，理論等電點為7.68，Nrf2相對分子量為113.72 ku，理論等電點為5.73。二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，Keap1主要具有BT

2、B和Kel ch兩個保守結(jié)構(gòu)域，其中BTB和泛素連接酶3結(jié)合，Kelch與 Nrf2結(jié)合。Nrf2主要包含堿性亮氨酸拉鏈，用于結(jié)合特殊的DNA序列。選擇保守結(jié)構(gòu)域序列，構(gòu)建原核表達載體，用于抗體制備和Western Blot檢測。
　　本研究采用實時熒光定量PCR對Keap1和Nrf2基因核酸表達量進行檢測，實驗組選取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌刺激刺激后6h、12h、24h、48h、72h五個點的家蠅幼蟲作定量分析，對照組為未做菌刺

3、激（0 h）的幼蟲，結(jié)果顯示，細菌刺激后Keap1基因呈下調(diào)趨勢，Nrf2基因呈上調(diào)趨勢。在組織定量分析，Keap1在脂肪體中表達量最高，具有顯著性，在血細胞中表達量最低。Nrf2在腸道中表達量最高，在表皮中最低。用含有Keap1-dsRNA和 Nrf2-dsRNA的工程菌干擾家蠅幼蟲，對干擾后目的基因RNA表達水平進行檢測，檢測結(jié)果顯示，Keap1和Nrf2基因均被敲低，效果顯著。幼蟲被干擾后再次菌刺激，Keap1敲低組的幼蟲在菌刺激