阻滯Nrf2基因?qū)ι橹缕つw角化相關(guān)基因及蛋白的影響研究.pdf

1、目的:研究Nrf2基因抑制及無機砷染毒對Nrf2通路相關(guān)基因及蛋白表達的影響，探討其在砷致皮膚細胞氧化應(yīng)激中的作用，為砷致皮膚損傷提供理論依據(jù)。
　　方法:1.慢病毒載體的構(gòu)建：依據(jù) Nrf2基因序列構(gòu)建Nrf2 shRNA,重組慢病毒表達載體，并進行測序鑒定。2.慢病毒包裝：Keap1抑制質(zhì)粒大量抽提擴增，共轉(zhuǎn)293T細胞，收集病毒上清，測定病毒滴度。3.用不同的慢病毒載體（Nrf2 shRNA1/2/3和空載體）分別感染HaC

2、aT細胞構(gòu)建Nrf2基因抑制HaCaT細胞系，感染復(fù)數(shù)為5，48小時后，用1μg/ml嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株。4.穩(wěn)轉(zhuǎn)株的鑒定：培養(yǎng)經(jīng)篩選獲得的穩(wěn)轉(zhuǎn)株，通過實時熒光定量法檢測細胞中Nrf2 mRNA表達水平。5.采用MTT還原法檢測細胞生長狀況，確定LC50及染毒濃度，染毒濃度分別為LC50的1/100、1/50、1/10。6.流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況。7.RT-PCR檢測細胞中Nrf2、Keap1、NF-κB、CBP、As3MT、K-

3、1、K-10、INV、LOR mRNA表達水平。8.ELISA試劑盒檢測細胞中HO-1、SAM、HCY、As3MT蛋白表達水平。
　　結(jié)果:1.慢病毒干擾載體構(gòu)建，經(jīng)基因測序，與目的基因序列完全匹配，慢病毒滴度為2×108TU/ml。2.建立的Nrf2基因抑制穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株中sh3最好，其基因的沉默效率為87％,作為后續(xù)實驗細胞。3.混合砷染毒模型細胞48h的LC50為210.00μmol/L，染毒濃度分別為LC50的1/100（2.

4、10μmol/）L，LC50的1/50（4.20μmol/L），LC50的1/10（21.00μmol/L）。4.Keap1基因抑制、2.10μmol/L混合砷染毒促進細胞增殖，細胞生長速度加快；隨染毒濃度增加（4.20μmol/L-21.00μmol/L）染毒時間延長（48h、72h)細胞多核細胞出現(xiàn)，脫壁明顯。5.與Nrf2抑制對照組相比，8h和24h時2.1μmol/L、4.20μmol/L、21μmol/L濃度組早期凋亡率均升高

5、，且隨染毒濃度的增加，凋亡率增加；48h后其早凋亡率均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。72h各濃度組早期凋亡率均低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。6.與Nrf2抑制對照組及8h相比，Keap1抑制對照組24h、48h、72hKeap1 mRNA表達均下調(diào)（P<0.01），且隨時間延長呈下降趨勢；2.1μmol/L、4.2μmol/L、21μmol/L濃度組Keap1 mRNA表達24h、48h均下調(diào)（P<0.0

6、1），表達隨濃度增大呈上升趨勢。與Nrf2抑制對照組相比，空白對照組和Keap1抑制對照組72hNrf2 mRNA表達均上調(diào)（P<0.01）；2.1μmol/L濃度組24h、48h和72hNrf2 mRNA表達均上調(diào)（P<0.01）；而4.2μmol/L和21μmol/L24h、72hNrf2 mRNA表達均下調(diào)（P<0.01）。與空白對照組和Nrf2抑制對照組相比，較低濃度組（2.1、4.20μmol/L）細胞中NF-κB、CBP m

7、RNA的表達上調(diào)；高濃度組（21.00μmol/L）長時間（48h、72h）NF-κB、CBP mRNA的表達下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。各濃度組K-l mRNA在24h、48h時表達較空白對照組和Nrf2抑制對照組下調(diào)，72h明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與空白對照組和Nrf2抑制對照組相比，較低濃度組（2.10、4.20μmol/L）長時間（48h、72h）K-l0 mRNA的表達上調(diào)，高濃度組K-l0

8、mRNA總體呈下調(diào)狀態(tài)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與空白對照組和Nrf2抑制對照組相比，較低濃度組（2.10、4.20μmol/L）INV、LOR mRNA24h和72h表達明顯升高，48h表達下調(diào)，21μmol/L濃度組INV、LOR mRNA24h后均呈下調(diào)狀態(tài)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。7.與空白對照組和Nrf2抑制對照組相比，4.2μmol/L和21μmol/L混合砷染毒促進As3MT mRNA表達，2.10

9、、4.20μmol/L濃度組8h、24h、48hAs3MT蛋白含量下調(diào)，72h表達上調(diào)，21μmol/L濃度組長時間48h、72h As3MT蛋白含量上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。8.與空白對照組相比，Keap1抑制對照組8h、48h和72hSAM蛋白含量均下調(diào)（P<0.01）；Nrf2抑制對照組24h、48h和72hSAM蛋白含量均上調(diào)（P<0.01）；與Nrf2抑制對照組相比，2.1μmol/L、4.2μmol/L、21

10、μmol/L濃度組隨時間延長（24h、48h、72h）SAM蛋白含量均下調(diào)（P<0.01），同時間不同濃度組隨濃度升高，呈下降趨勢，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與空白對照組和Nrf2抑制對照組相比，8h、24h、48h和72hHCY蛋白含量均上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；空白對照組和Keap1抑制對照組24h后HCY蛋白含量均低于Nrf2抑制對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與空白對照組和Nrf2抑制對照組相

11、比，2.10、4.20μmol/L濃度組HO-1蛋白含量由8h、24h的表達上調(diào)轉(zhuǎn)至48h、72h表達逐漸下調(diào)，21μmol/L濃度組HO-1蛋白含量基本維持下調(diào)水平；且均隨濃度增加表達逐漸降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　結(jié)論:1.混合砷染毒能引起細胞形態(tài)改變，低濃度促進細胞增殖，高濃度促進細胞凋亡。2.Nrf2基因抑制聯(lián)合混合砷染毒細胞， Nrf2通路相關(guān)基因（Nrf2、Keap1、NF-κB、CBP、As3MT