氟對小鼠成釉細(xì)胞Nrf2信號(hào)通路的作用研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　氟中毒(Fluorosis)是一種慢性全身性疾病，是由于長期生活在高氟環(huán)境中通過飲水、食物和空氣而攝入過量的氟，導(dǎo)致人體中氟元素蓄積。微量元素氟對人體健康的影響有其特殊性，適量時(shí)可以有效促進(jìn)骨質(zhì)生長、降低齲病的發(fā)病率，過量時(shí)則引起氟中毒，使機(jī)體引起骨相和非骨相損害，從而引起氟斑牙、氟骨癥等牙齒和骨骼的病變，同時(shí)還能引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝、腎以及內(nèi)分泌系統(tǒng)等多種器官的病理變化，但由于氟對骨組織具有特殊的親和力，使

2、氟對骨相的損害較非骨相的損害更為敏感。氟引起的骨相損害中，氟斑牙是氟中毒最早出現(xiàn)、最顯而易見的特異性體征，嚴(yán)重?fù)p害牙齒的正常功能，又影響美觀。氟斑牙的病理變化復(fù)雜多樣，其形成是由于牙齒在礦化期階段，持續(xù)攝入過量的氟而引起的，但氟斑牙發(fā)病的具體分子生物學(xué)機(jī)制尚未充分闡明。
　　牙器官形成過程與成釉細(xì)胞密切相關(guān)，成釉細(xì)胞是對氟中毒最敏感的細(xì)胞，大量的研究提出氟斑牙形成的可能致病途徑是由于氟干擾成釉細(xì)胞的增殖、分化，加劇成釉細(xì)胞的凋亡；

3、干擾成釉細(xì)胞中釉基質(zhì)的合成、分泌及移除。因此，成釉細(xì)胞是研究氟斑牙發(fā)病機(jī)制的重要研究對象，也是關(guān)鍵突破口。本實(shí)驗(yàn)室曾通過建立氟斑牙的大鼠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，研究了氟對大鼠切牙成釉細(xì)胞凋亡、DNA損傷以及Fas表達(dá)的影響，但是成釉細(xì)胞如何在氟的毒理學(xué)作用下形成以氟斑牙為主要表現(xiàn)的氟骨相損害，其機(jī)制仍需深入探討。
　　近年來，在分子水平上廣泛研究了氟與氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的關(guān)系，氟中毒的損傷作用主要是通過對機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激引起，而細(xì)胞凋亡在牙

4、齒發(fā)育中起著重要作用，是導(dǎo)致氟對牙齒損害的關(guān)鍵因素之一。在細(xì)胞生長發(fā)育以及對外界刺激的反應(yīng)中細(xì)胞凋亡貫穿整個(gè)生物學(xué)發(fā)展過程，而氧化應(yīng)激又是凋亡發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，是氟中毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵。新近的研究發(fā)現(xiàn)，作為核轉(zhuǎn)錄因子的NF-E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor2，Nrf2)和其胞質(zhì)接頭蛋白 Keap1(Kelch-like ECH-associated protein1，Keap1)是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的中樞調(diào)節(jié)者，在抗

5、氧化應(yīng)激方面起著關(guān)鍵作用。在機(jī)體受到氧化應(yīng)激損傷時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子 Nrf2能夠和抗氧化反應(yīng)元件(Antioxidant response element，ARE)結(jié)合，對Nrf2下游存在的一系列的Ⅱ相解毒酶基因，如血紅素氧合酶-1(Hemeoxygenase-1，HO-1)、醌氧化還原酶1(NAD(P)H dehydrogenase quinone1，NQO1)等抗氧化酶基因進(jìn)行調(diào)控及誘導(dǎo)，從而增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化應(yīng)激能力。
　　本研究利

6、用體外培養(yǎng)小鼠成釉細(xì)胞株，以氟引起小鼠成釉細(xì)胞氧化損傷為基礎(chǔ)，開展氟對氧化應(yīng)激、DNA損傷、細(xì)胞增殖與凋亡以及對Nrf2信號(hào)通路的作用研究。檢測氟對成釉細(xì)胞氧化應(yīng)激，DNA損傷，Nrf2、HO-1、NQO1的基因和Nrf2蛋白的表達(dá)，細(xì)胞增殖與凋亡的影響，探討Nrf2信號(hào)通路在氟致成釉細(xì)胞損害中的作用，從而為深入研究氟斑牙發(fā)病機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。既然氧化應(yīng)激被普遍認(rèn)為是氟中毒的重要機(jī)理，因此，探討抗氧化劑的抗氧化作用在氟中毒防治中是至

7、關(guān)重要的。本課題還將研究以枸杞多糖、原花青素、硒、鋅為代表的抗氧化劑對氟誘導(dǎo)成釉細(xì)胞DNA損傷的保護(hù)作用，探索氟中毒的防治措施。
　　本研究主要由以下3部分組成：
　　第一部分：氟對小鼠成釉細(xì)胞氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖與凋亡的作用研究目的：探討氟對小鼠成釉細(xì)胞存活率的影響，確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)的氟染毒劑量。觀察不同劑量的氟對小鼠成釉細(xì)胞氧化應(yīng)激、DNA損傷、細(xì)胞周期和凋亡的影響。方法：建立并改良小鼠成釉細(xì)胞株的培養(yǎng)方法，應(yīng)用四唑鹽(MTT

8、)比色法，觀察氟對培養(yǎng)的成釉細(xì)胞增殖活力的影響；測定小鼠成釉細(xì)胞丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性；用單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)(SCGE)和酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測氟對成釉細(xì)胞 DNA的損傷；用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測氟對成釉細(xì)胞的細(xì)胞周期變化及凋亡的改變。
　　結(jié)果：改良后細(xì)胞培養(yǎng)方法重復(fù)性好，成釉細(xì)胞生長穩(wěn)定，純化效果好，完全適合建立氟中毒的體外模型。氟對成釉細(xì)胞有一定的細(xì)

9、胞毒性，隨著染氟劑量的升高，細(xì)胞的存活率逐漸降低，SOD的活性逐漸下降，GSH-Px的活性被抑制，MDA含量增加；DNA損傷結(jié)果顯示，除染氟劑量為0.25mmol/L時(shí)，隨著染氟劑量的升高，各劑量組氟造成的細(xì)胞DNA彗星樣尾長、Olive尾距、尾DNA％及尾/頭長比與對照組相比均明顯增加。其中尾長、Olive尾距在0.50、1.00、4.00 mmol/L染氟劑量時(shí)與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。除染氟劑量為2.00mmo

10、l/L外，其他組隨著染氟劑量的升高，8-OHdG含量逐漸升高，其中在染氟劑量為0.50，1.00，4.00mmol/L時(shí)，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。染氟劑量為2.00mmol/L時(shí)，與對照組比較，小鼠成釉細(xì)胞 G0/G1細(xì)胞構(gòu)成比升高，G2/M細(xì)胞構(gòu)成比升高，S期細(xì)胞構(gòu)成比下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其余各組小鼠成釉細(xì)胞G0/G1、G2/M、S期細(xì)胞構(gòu)成比與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。小鼠成釉細(xì)胞的凋

11、亡率在染氟劑量為4.00 mmol/L時(shí)，與對照組相比，凋亡率升高(P<0.05)。
　　結(jié)論：氟在一定劑量條件下抑制小鼠成釉細(xì)胞的增殖，過量氟能使小鼠成釉細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，同時(shí)導(dǎo)致成釉細(xì)胞DNA損傷，一定劑量的氟使細(xì)胞停滯于S期，降低細(xì)胞活力，改變細(xì)胞周期的分布，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　第二部分：氟對小鼠成釉細(xì)胞Nrf2信號(hào)通路的影響
　　目的：在基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白表達(dá)水平，觀察不同劑量的氟處理和特丁基對苯二酚(

12、Tertiary butylhydroquinone，tBHQ)誘導(dǎo)后成釉細(xì)胞 HO-1、NQO1、Nrf2 mRNA和Nrf2蛋白的表達(dá)水平，探討Nrf2信號(hào)通路和tBHQ對氟誘導(dǎo)的成釉細(xì)胞毒性的作用。
　　方法：RT-PCR法測定成釉細(xì)胞HO-1、NQO1、Nrf2 mRNA的表達(dá)；Western-Blot法測定成釉細(xì)胞Nrf2蛋白含量。
　　結(jié)果：單獨(dú)染氟組，成釉細(xì)胞內(nèi)Nrf2 mRNA和Nrf2蛋白表達(dá)隨氟劑量的升高

13、逐漸增強(qiáng)。只有1.00和4.00mmol/L染氟組細(xì)胞內(nèi) Nrf2 mRNA表達(dá)與對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各染氟組HO-1 mRNA表達(dá)都比對照組高，只有在0.50、1.00、2.00和4.00mmol/L劑量組與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。除在4.00mmol/L劑量組外，其余染氟組NQO1 mRNA表達(dá)量都比對照組高，但只有在1.00mmol/L劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在0.25

14、、2.00mmol/L染氟劑量組，細(xì)胞漿內(nèi) Nrf2蛋白與對照組相比表達(dá)有所增加(P<0.05)。細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白在2.00、4.00mmol/L染氟劑量時(shí)表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。經(jīng)tBHQ預(yù)處理后，各組Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA和細(xì)胞漿、細(xì)胞核中Nrf2蛋白表達(dá)與同劑量染氟tBHQ未處理組相比均升高。在0.00、0.25、0.50、2.00、4.00 mmol/L染氟劑量，Nrf2 mRNA與同劑量染氟tBHQ未處理

15、組相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組HO-1 mRNA表達(dá)都比同劑量染氟tBHQ未處理組高，只有在0.00、0.50、和4.00mmol/L染氟組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組NQO1 mRNA表達(dá)都比同劑量染氟tBHQ未處理組高，只有在0.25、4.00mmol/L染氟組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在染氟劑量為0.25、1.00、2.00、4.00mmol/L時(shí)，tBHQ處理組核漿內(nèi)Nrf2蛋白比值與tBHQ處

16、理對照組(0.00mmol/L NaF)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且呈升高趨勢。在染氟劑量為0.00、0.50、4.00mmol/L時(shí)，tBHQ處理組與tBHQ未處理組核漿內(nèi)Nrf2蛋白比值相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：一定劑量的氟作用成釉細(xì)胞后可誘導(dǎo)Nrf2基因和蛋白的表達(dá)，進(jìn)而使Nrf2信號(hào)通路下游II相抗氧化酶基因HO-1和NQO1表達(dá)增加；tBHQ可誘導(dǎo)成釉細(xì)胞HO-1、NQO1、Nrf2

17、mRNA的表達(dá)增強(qiáng)，能夠在一定程度上拮抗氟對成釉細(xì)胞的毒性作用，對細(xì)胞具有保護(hù)作用。
　　第三部分：抗氧化劑對氟致小鼠成釉細(xì)胞DNA損傷的研究
　　目的：研究枸杞多糖、原花青素、硒、鋅分別與氟聯(lián)合作用對小鼠成釉細(xì)胞DNA損傷的影響。
　　方法：成釉細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24h后換液并加入不同劑量的抗氧化劑：枸杞多糖(100mg/L、200mg/L、400mg/L)、原花青素(10mg/L、25mg/L、50mg/L)、亞硒酸鈉(

18、2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)、硫酸鋅(5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L)，處理相應(yīng)時(shí)間后換液，加入不同劑量的氟處理細(xì)胞，然后收集細(xì)胞采用單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)檢測DNA單鏈斷裂。
　　結(jié)果：枸杞多糖、原花青素、硒、鋅各處理組的Olive尾距與同劑量單獨(dú)染氟組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，且均低于對照組。染氟劑量為0.25，0.50，2.00，4mmol/L，400mg/L枸杞多糖處理

19、組比100mg/L、200mg/L枸杞多糖處理組的Olive尾距小(P<0.05)；染氟劑量為0.00，0.25，0.50，1.00 mmol/L，10mg/L原花青素組比25mg/L、50mg/L原花青素處理組的Olive尾距小(P<0.05)，但是隨著染氟劑量的升高，25mg/L、50mg/L原花青素組比10mg原花青素處理組的Olive尾距小(P<0.05)；染氟劑量為0.00，0.25，0.50，1.00，2.00，4.00mm