促腸道PEPT1作用藥用輔料的篩選及機(jī)制研究.pdf

1、目的：寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（peptide transporter1，PEPT1）是一種主要表達(dá)于小腸上皮細(xì)胞刷狀緣膜側(cè)、以氫離子濃度梯度差為動(dòng)力的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其底物非常廣泛，可介導(dǎo)二肽、三肽以及類(lèi)肽藥物的口服吸收。PEPT1屬于高容量、低親和力的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，因此其對(duì)大部分底物藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)效率有限，導(dǎo)致藥物口服生物利用度較低。目前專(zhuān)屬的PEPT1轉(zhuǎn)運(yùn)功能促進(jìn)劑未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，無(wú)藥理活性、低毒且具有較強(qiáng)促PEPT1轉(zhuǎn)運(yùn)功能的物質(zhì)的研究可能是提高PE

2、PT1底物藥物口服吸收的新思路。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)某些藥用輔料對(duì)PEPT1底物藥物有一定的促吸收作用，據(jù)此，本文以常用藥用輔料為研究對(duì)象，考察所選輔料對(duì)PEPT1轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響，利用分子生物學(xué)技術(shù)探討活性藥用輔料促吸收機(jī)制，并通過(guò)整體動(dòng)物模型對(duì)其促PEPT1作用進(jìn)一步驗(yàn)證和研究，希望篩選出具有較強(qiáng)PEPT1促進(jìn)作用的輔料。
　　方法：本課題采用Caco-2細(xì)胞模型，以MTT法考察了22種常用藥用輔料對(duì)細(xì)胞活性的影響，確定

3、細(xì)胞攝取試驗(yàn)中輔料的濃度梯度；進(jìn)而以PEPT1經(jīng)典底物Gly-Sar為探針?biāo)幬铮肏PLC-MS/MS法測(cè)定藥物在細(xì)胞破碎液中的含量，計(jì)算細(xì)胞攝取率（Uptake ratio，UR）評(píng)價(jià)藥用輔料對(duì)Caco-2細(xì)胞膜上PEPT1功能的影響。通過(guò)Western blot以及熒光實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定活性藥用輔料對(duì)Caco-2細(xì)胞中PEPT1蛋白表達(dá)量以及mRNA表達(dá)量的影響。運(yùn)用熒光探針從胞內(nèi)pH以及膜流動(dòng)性?xún)蓚€(gè)方面考察了活性輔料對(duì)Caco-

4、2細(xì)胞中PEPT1影響的作用機(jī)制。為了進(jìn)一步驗(yàn)證篩選出的活性藥用輔料對(duì)PEPT1底物藥物口服吸收的影響，本文采用福辛普利鈉為探針?biāo)幬?，用HPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定大鼠體內(nèi)原藥以及活性代謝物福辛普利拉的濃度，考察RH40、EL35、PEG400、吐溫20以及吐溫80對(duì)PEPT1轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響，并采用蛋白印跡法測(cè)定大鼠小腸各段PEPT1蛋白表達(dá)水平的變化。
　　結(jié)果：細(xì)胞攝取試驗(yàn)結(jié)果表明加入EL35、RH40、PEG400、PEG

5、6000、Eudragit L100、Eudragit L100-55、Eudragit RL PO、HPMC E30、吐溫20、吐溫80、CMC-Na、CMS-Na以及殼聚糖，可顯著影響Gly-Sar的細(xì)胞攝取量，推測(cè)這些輔料對(duì)PEPT1的功能有著不可忽視的作用。其余9種輔料（泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、PEG800、PEG1500、PEG4000、PVP K30、環(huán)糊精、Transcutol P、微晶纖維素）對(duì)探針二肽的攝取量無(wú)

6、顯著性影響。Western blot結(jié)果表明PEG400、CMS-Na、EL35、RH40、吐溫20、吐溫80、Eudragit L100以及Eudragit L100-55均可增加PEPT1膜蛋白的含量，而活性藥用輔料并不能顯著誘導(dǎo)或抑制PEPT1基因的表達(dá)，推測(cè)蛋白水平的增加主要是由于胞質(zhì)內(nèi)的PEPT1向細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)移和嵌入的結(jié)果。部分活性藥用輔料可在一定程度上降低胞內(nèi)pH值，影響程度依次為吐溫20＞EL35>吐溫80> PEG400

7、≈ RH40。此外，PEG6000、殼聚糖、CMS-Na以及Eudragit L100可以減低孵育液的pH值，推測(cè)細(xì)胞內(nèi)外的氫離子濃度梯度差增加可能是上述9種輔料促進(jìn)PEPT1底物藥物攝取的原因之一。膜流動(dòng)性結(jié)果表明PEG400、EL35、RH40、吐溫20、吐溫80均可增加Caco-2細(xì)胞的膜流動(dòng)性。因此，輔料PEG400、EL35、RH40、吐溫20、吐溫80的顯著促PEPT1轉(zhuǎn)運(yùn)作用與細(xì)胞膜上蛋白含量增加、細(xì)胞內(nèi)外氫離子濃度梯度增

8、大以及細(xì)胞膜流動(dòng)性增加相關(guān)。大鼠藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)結(jié)果顯示，PEG400、RH40、EL35、吐溫20及吐溫80各個(gè)輔料組福辛普利鈉的相對(duì)生物利用度分別為90.98％、725.27%、190.65%、240.00%和156.17%，代謝物福辛普利拉的相對(duì)生物利用度分別為171.25%、207.33%、253.33%、253.76%、200.05%。灌胃給予上述5種活性輔料24h后，各個(gè)輔料對(duì)大鼠十二指腸PEPT1蛋白表達(dá)豐度沒(méi)有顯著影響，對(duì)空腸

9、和回腸PEPT1蛋白表達(dá)均表現(xiàn)出一定的下調(diào)作用，提示上述輔料確實(shí)可以通過(guò)影響腸道PEPT1轉(zhuǎn)運(yùn)功能促進(jìn)底物藥物的吸收。
　　結(jié)論：綜上所述，本文通過(guò)考察22種藥用輔料在Caco-2細(xì)胞模型中促進(jìn)PEPT1轉(zhuǎn)運(yùn)的作用，篩選出14種輔料進(jìn)一步進(jìn)行PEPT1促吸收作用機(jī)制研究，最后在整體動(dòng)物水平選取5種具有顯著促進(jìn)PEPT1作用的活性藥用輔料驗(yàn)證了其對(duì)底物的吸收促進(jìn)作用。研究結(jié)果顯示RH40、EL35等多種輔料均具有促進(jìn)PEPT1轉(zhuǎn)運(yùn)作