大黃素對布魯菌感染小鼠的保護效果及可能機制研究.pdf

1、目的：
　　通過構(gòu)建小鼠感染布魯菌模型,觀察單體大黃素對布魯菌感染小鼠的保護效果,體外培養(yǎng)小鼠巨噬細胞，研究大黃素對布魯菌侵染小鼠巨噬細胞功能的調(diào)節(jié),為尋找新的藥物治療布魯菌病提供理論和實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1、體內(nèi)實驗：采用VITEK Compact2全自動微生物分析系統(tǒng)、16SrDNA分子生物學(xué)方法，對實驗室保存布魯菌株進行再次鑒定；以不同濃度菌液注射小鼠，通過SAT和脾臟載菌初篩布魯菌感染小鼠的濃度，然后以

2、初篩濃度腹腔注射小鼠，構(gòu)建布魯菌感染小鼠模型；取60只SPF級BALB/c雌性小鼠隨機平均分成6組，設(shè)為8mg/mL大黃素組、4mg/mL大黃素組、2mg/mL大黃素組、多西環(huán)素組、PBS組、空白組，進行灌胃處理（除空白組外）后，通過腹腔菌落計數(shù)、體重指數(shù)、肝脾指數(shù)及組織病理的變化評價大黃素對布魯菌感染小鼠的保護效果。
　　2、體外實驗：取BALB/c小鼠分離骨髓細胞，加入MG-CSF誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，用小鼠F4/80抗體、CD11b

3、抗體標(biāo)記細胞，流式檢測骨髓細胞分化為巨噬細胞(MΦ)的比例；通過MTT法檢測不同濃度大黃素對小鼠MΦ的存活率影響，同時以多西環(huán)素為對照，比較兩種藥物的IC50；用布魯菌侵染小鼠巨噬細胞（MΦ和細菌比例為100:1）培養(yǎng)4h，然后加入大黃素作用后，培養(yǎng)1h、6h、12h、24h、48h，通過菌落計數(shù)法檢測大黃素對MΦ內(nèi)布魯菌存活的影響，然后用qRT-PCR法檢測大黃素對侵染布魯菌的MΦ分泌TNF-α、IL-6、IFN-γ基因轉(zhuǎn)錄的影響，同

4、時用ELISA法檢測各組MΦ培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6、IFN-γ的含量。
　　結(jié)果：
　　1、體內(nèi)實驗結(jié)果：經(jīng)過細菌生化、16SrDNA鑒定結(jié)果一致,均證實該實驗菌株為羊布魯菌；羊布魯菌感染小鼠的初篩濃度為1×105CFU，并且該濃度布魯菌感染小鼠模型構(gòu)建成功；大黃素對布魯菌感染小鼠模型的影響：8mg/mL和4mg/mL大黃素組腹腔載菌數(shù)量的lgCFU值分別為（4.023±0.199）（4.771±0.498），明顯低

5、于PBS組(5.161±0.501)；2mg/mL、4mg/mL、8mg/mL大黃素組小鼠體重指數(shù)明顯高于PBS組，而脾臟系數(shù)明顯低于PBS組；8mg/mL大黃素組小鼠的肝臟系數(shù)明顯低于PBS組，且與多西環(huán)素組無明顯差異；與PBS組比較，2mg/mL、4mg/mL、8mg/mL大黃素組小鼠脾臟均有不同程度的改善，組織病理結(jié)構(gòu)排列規(guī)則，白髓、紅髓分界較清楚；8mg/mL大黃素組小鼠肝細胞分界清楚，排列正常。
　　2、體外實驗結(jié)果：培

6、養(yǎng)第8天，骨髓細胞誘導(dǎo)分化為巨噬細胞的比例為91.28％；大黃素的IC50（608.4μg/mL）明顯高于多西環(huán)素的IC50（225.5μg/mL）；菌落計數(shù)結(jié)果：6h、12h、24h、48h大黃素組lgCFU值均顯著低于空白組，大黃素組間比較，24h大黃素組的lgCFU值最低，且低于多西環(huán)素組；qRT-PCR結(jié)果：24h大黃素組TNF-α、IL-6、IFN-γ表達水平比其他組高（1h、6h、12h、48h）；相同時間點，大黃素組TNF

7、-α基因表達水平均高于布魯菌組。除1h、12h大黃素組外，其余各組IL-6表達比布魯菌組高；6 h、12 h、24 h大黃素組比布魯菌組的IFN-γ基因表達明顯上調(diào)；12 h大黃素組的IFN-γ基因表達（5.4370±0.458）最高，且與24 h大黃素組（5.3495±0.336）比較無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。ELISA結(jié)果：與布魯菌組比較，6h、12h、24h大黃素組TNF-α、IL-6、IFN-γ含量明顯增加，24h大黃素組TNF-α、I