大黃素通過(guò)TLR4-MyD88信號(hào)通路對(duì)顱腦爆震傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、大黃素是我國(guó)傳統(tǒng)中藥大黃的有效成分之一。然而，大黃素通過(guò)抑制炎癥作用實(shí)現(xiàn)腦損傷后神經(jīng)保護(hù)的機(jī)制尚未明確，有待進(jìn)一步研究。因此本研究首先探索并成功建立穩(wěn)定的大鼠顱腦爆震傷模型，再通過(guò)大黃素干預(yù)，明確了大黃素對(duì)顱腦爆震傷造成的腦組織損傷的保護(hù)作用。最后以TLR4為作用靶點(diǎn)，通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討了大黃素保護(hù)顱腦爆震傷的機(jī)制，為臨床治療顱腦爆震傷奠定理論基礎(chǔ)。
　　1.新型大鼠顱腦爆震傷模型的建立
　　使用1 ml1.5％的戊巴比妥鈉腹

2、腔注射充分麻醉大鼠，麻醉后，將大鼠的四肢以及頭部固定于鋁制箱體的動(dòng)物保護(hù)艙內(nèi)，使大鼠背部緊靠在保護(hù)艙側(cè)壁，調(diào)節(jié)保護(hù)艙側(cè)壁上的圓形爆炸窗口以及大鼠的位置，最終使得大鼠的額頂枕部全部置于爆炸窗內(nèi)，充分保護(hù)大鼠除頭顱之外的所有部位。將400mgTNT當(dāng)量紙質(zhì)電雷管放置在爆炸窗圓心側(cè)方水平處，分別在距離7.5 cm、10 cm以及15cm的位置處將雷管引爆。觀察各爆炸距離組大鼠在受傷后的相關(guān)生理行為，測(cè)量大鼠腦組織含水量以及進(jìn)行病理學(xué)檢查，確定

3、大鼠顱腦爆震傷動(dòng)物模型成功與否。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)組大鼠均出現(xiàn)顯著的呼吸節(jié)律的變化，主要表現(xiàn)在出現(xiàn)短暫的呼吸暫停，呼吸變深變慢。在7.5cm爆炸組的大鼠在爆炸三天后該實(shí)驗(yàn)組所有的大鼠全部死亡。其余實(shí)驗(yàn)組未出現(xiàn)死亡。腦含水量結(jié)果顯示，爆炸組大鼠的腦含水量明顯高于正常大鼠。病理切片實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，爆炸距離為10 cm實(shí)驗(yàn)組大鼠的腦組織中出現(xiàn)明顯損傷以及腦水腫。而爆炸距離為15cm實(shí)驗(yàn)組的大鼠腦組織中沒(méi)有明顯的損傷。上述結(jié)果提示，10 cm為建

4、立大鼠顱腦爆震傷動(dòng)物模型的最佳爆炸距離，動(dòng)物模型建立成功。
　　2.大黃素對(duì)大鼠顱腦爆震傷腦組織具有顯著的保護(hù)作用
　　2.1大黃素能夠顯著降低顱腦爆震傷模型大鼠腦組織中的IL-1β含量
　　為了檢測(cè)大鼠顱腦爆震傷之后腦組織中促炎因子的變化情況，使用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顱腦爆震傷模型大鼠腦組織中促炎因子IL-1β的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示顱腦爆震傷模型大鼠腦組織中的IL-1β含量顯著高于正常的大鼠腦組織中的IL-1β含量。為了

5、檢測(cè)大黃素對(duì)爆震傷模型大鼠腦組織中促炎因子IL-1β的含量的影響，使用大黃素作用顱腦爆震傷模型大鼠，分別檢測(cè)顱腦爆震傷后第1d，2d，3d，5d，7d后大鼠腦組織中促炎因子IL-1β的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大黃素在實(shí)驗(yàn)的上述各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均能夠顯著抑制顱腦爆震傷模型大鼠腦組織中IL-1β含量，并最終可使IL-1β含量基本降低至正常大鼠的水平。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，大鼠受到顱腦爆震傷之后，腦組織中炎癥細(xì)胞因子IL-1β含量顯著升高，但是大黃素能顯著的

6、抑制IL-1β分泌。提示大黃素能夠抑制由顱腦爆震傷引起的炎癥反應(yīng)。
　　2.2大黃素能夠顯著降低顱腦爆震傷模型大鼠腦組織中的TNF-a含量。
　　為了檢測(cè)大鼠顱腦爆震傷之后腦組織中促炎因子的變化情況，使用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顱腦爆震傷模型大鼠腦組織中促炎因子TNF-a的含量。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明顱腦爆震傷模型大鼠腦組織中的TNF-a含量顯著高于正常的大鼠腦組織中的TNF-a含量，第5天時(shí)TNF-a含量略有下降，但仍顯著高于對(duì)

7、照組。為了檢測(cè)大黃素對(duì)爆震傷模型大鼠腦組織中促炎因子TNF-a的含量的影響，使用大黃素作用顱腦爆震傷模型大鼠，分別檢測(cè)顱腦爆震傷后1d，2d，3d，5d和第7天后大鼠腦組織中促炎因子TNF-a的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大黃素在不同時(shí)間點(diǎn)均能夠抑制顱腦爆震傷模型大鼠腦組織中TNF-a含量，使TNF-a含量基本降低至正常大鼠的水平。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，大鼠受到顱腦爆震傷之后，腦組織中炎癥細(xì)胞因子TNF-a含量顯著升高，但是大黃素能顯著的抑制TNF-

8、a的分泌。提示大黃素能夠抑制由顱腦爆震傷引起的炎癥反應(yīng)。
　　2.3大黃素顯著降低顱腦爆震傷模型大鼠腦組織中的含水量
　　為了探討大黃素對(duì)顱腦爆震傷后大鼠腦組織中含水量的影響，即大黃素對(duì)緩解顱腦爆震傷后形成的腦組織水腫之間的關(guān)系。采用干濕法檢測(cè)了各個(gè)實(shí)驗(yàn)組顱腦爆震傷模型大鼠腦組織中的含水量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組正常大鼠腦組織中的含水量相比，顱腦爆震傷模型大鼠腦組織中的含水顯著增高，含水量隨時(shí)間的推移逐漸減少，但仍然顯著高于

9、正常的大鼠水平。大黃素能夠顯著的降低顱腦爆震傷模型大鼠腦組織中的含水量。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示大黃素能夠顯著減輕顱腦爆震傷引起的腦水腫現(xiàn)象。
　　2.4大黃素顯著減輕顱腦爆震傷模型大鼠的腦組織損傷
　　為了進(jìn)一步觀察大黃素對(duì)顱腦爆震傷模型大鼠的腦組織的保護(hù)情況，使用HE染色和電鏡觀察大黃素處理前后大鼠顱腦爆震傷模型的腦組織損傷的情況變化。結(jié)果顯示，大鼠顱腦爆震傷模型的腦組織中出現(xiàn)明顯的損傷現(xiàn)象:毛細(xì)血管損傷，細(xì)胞間隙以及血管間隙的

10、擴(kuò)大，神經(jīng)纖維破損，大量的神經(jīng)元丟失現(xiàn)象，彌散性蛛網(wǎng)膜下腔出血以及水腫現(xiàn)象。電鏡下可見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞核染色質(zhì)有輕度聚集，細(xì)胞漿內(nèi)，線粒體腫脹明顯，核糖體丟失。然而大黃素處理組的大鼠腦組織中各種病理性的變化較未經(jīng)大黃素處理組相比程度減輕。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，大黃素能夠有效的減輕顱腦爆震傷對(duì)大鼠腦組織的損傷作用。
　　3.大黃素對(duì)顱腦爆震傷的保護(hù)機(jī)制研究
　　3.1大黃素可顯著抑制OGD小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1β和TNF-a
　

11、　為了檢測(cè)大黃素對(duì)OGD小膠質(zhì)細(xì)胞中促炎因子IL-1β和TNF-a含量的影響，使用不同濃度的大黃素刺激OGD模型小膠質(zhì)細(xì)胞，ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OGD模型小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-1β和TNF-a分泌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，OGD模型小膠質(zhì)細(xì)胞上清中IL-1β和TNF-a的濃度顯著高于正常的小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)照組。大黃素能夠抑制OGD模型小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1β和TNF-a，并呈現(xiàn)濃度依賴性。當(dāng)大黃素的終濃度為40μmol/L時(shí)，

12、作用效果最明顯。提示40μmol/L大黃素可有效的抑制OGD模型小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥因子IL-1β和TNF-a分泌，因此在后續(xù)的相關(guān)試驗(yàn)中選擇40μmol/L作為大黃素的最佳作用濃度。
　　3.2大黃素顯著下調(diào)OGD模型小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4的蛋白和mRNA表達(dá)量
　　為了進(jìn)一步確定大黃素對(duì)OGD模型小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4相關(guān)信號(hào)通路的活化的影響，采用Western blot和qRT-PCR兩種實(shí)驗(yàn)方法分別檢測(cè)了大黃素刺激前后O

13、GD模型小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4的蛋白和mRNA表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常小膠質(zhì)細(xì)胞相比，OGD模型小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4的蛋白和mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)。但是經(jīng)過(guò)40μmol/L大黃素刺激后OGD模型小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4的蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示大黃素能夠顯著抑制OGD模型小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4的表達(dá)。
　　3.3大黃素抑制OGD模型小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4介導(dǎo)的MyD88依賴途徑的活化
　　為了進(jìn)一步確定大

14、黃素對(duì)OGD模型小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4介導(dǎo)的相關(guān)信號(hào)通路的活化的影響，采用Western blot實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)大黃素刺激OGD模型小膠質(zhì)細(xì)胞后TLR4信號(hào)通路相關(guān)信號(hào)分子MyD88的蛋白表達(dá)水平以及IκB的磷酸化水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常的小膠質(zhì)細(xì)胞相比，OGD模型小膠質(zhì)細(xì)胞中MyD88的蛋白表達(dá)水平以及IκB的磷酸化水平顯著上調(diào)。但是經(jīng)過(guò)40μmol/L大黃素刺激后，顯著抑制OGD模型小膠質(zhì)細(xì)胞的MyD88的蛋白表達(dá)水平以及IκB的磷酸

15、化水平。提示大黃素能夠抑制TLR4介導(dǎo)的MyD88依賴途徑信號(hào)通路的活化。
　　3.4大黃素通過(guò)抑制OGD模型小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4介導(dǎo)的MyD88依賴途徑的活化降低IL-1β和TNF-a炎癥因子的分泌
　　為了進(jìn)一步確定大黃素是否是通過(guò)抑制OGD模型小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4介導(dǎo)的MyD88依賴途徑的活化而發(fā)揮抑制炎癥因子的釋放，首先使用TLR4抗體預(yù)處理OGD模型小膠質(zhì)細(xì)胞。采用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β和

16、TNF-a的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，OGD模型小膠質(zhì)細(xì)胞中IL-1β和TNF-a含量顯著上升，大黃素可顯著抑制OGD模型小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1β和TNF-a。此外，使用TLR4抗體預(yù)處理OGD模型小膠質(zhì)細(xì)胞后，大黃素對(duì)OGD模型小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1β和TNF-a不會(huì)產(chǎn)生明顯影響。接下來(lái)使用同樣的方式對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行處理，并采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TLR4下游相關(guān)信號(hào)分子MyD88表達(dá)以及IκB的磷酸化水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)

17、果顯示，OGD模型小膠質(zhì)細(xì)胞中MyD88表達(dá)以及Iκβ的磷酸化顯著上調(diào)，大黃素可有效下調(diào)MyD88表達(dá)以及IκB的磷酸化。使用大黃素刺激TLR4抗體預(yù)處理OGD模型小膠質(zhì)細(xì)胞后，OGD模型小膠質(zhì)細(xì)胞中MyD88表達(dá)以及IκB的磷酸化水平?jīng)]有明顯變化。
　　綜上所述，本研究首次建立并使用了本課題組前期的穩(wěn)定的大鼠顱腦爆震傷動(dòng)物模型，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展創(chuàng)造了良好的必備的實(shí)驗(yàn)條件。接下來(lái)，檢測(cè)了大黃素對(duì)顱腦爆震傷造成的大鼠腦組織損害的影響

18、，進(jìn)一步證實(shí)大黃素通過(guò)抑制相關(guān)促炎因子的釋放，降低爆震傷引起的繼發(fā)性腦損傷起到保護(hù)神經(jīng)功能的作用。最后，本研究詳細(xì)探討了大黃素減輕顱腦爆震傷繼發(fā)性損傷的作用機(jī)制，證實(shí)大黃素通過(guò)抑制TLR4介導(dǎo)的MyD88信號(hào)通路活化，進(jìn)一步抑制小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子的分泌，從而減輕爆震傷后炎癥反應(yīng)引起的相關(guān)并發(fā)癥，起到保護(hù)神經(jīng)功能的作用。本研究首次發(fā)現(xiàn)了大黃素通過(guò)抑制TLR4介導(dǎo)的MyD88信號(hào)通路的活化發(fā)揮保護(hù)顱腦爆震傷的作用機(jī)制。為臨床上治療顱腦爆震傷