丙烯酰胺對紋狀體神經(jīng)末梢多巴胺相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響.pdf

1、丙烯酰胺(Acrylamide,ACR)是一種從水合丙烯腈中提取出來的具有乙烯基的水溶性有機(jī)化合物,是國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于化工冶煉、污水處理、紡織加工及化妝品生產(chǎn)的一種化學(xué)原料。早在20世紀(jì)70年代就有職業(yè)性中毒的報(bào)道,主要表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,除職業(yè)接觸外,在飲用水、高溫油炸食品和食品的包裝材料中都可以檢測到單體丙烯酰胺的存在,由于其可以直接經(jīng)口進(jìn)入人體,從而引起了社會的高度關(guān)注。有關(guān)流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),丙烯酰胺對人和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物除了有

2、生殖毒性、遺傳毒性及致癌性等作用以外,還有明顯的神經(jīng)毒性。丙烯酰胺急性、亞急性中毒主要以損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)為主,表現(xiàn)為神經(jīng)精神癥狀和小腦共濟(jì)失調(diào),而慢性中毒則以損害周圍神經(jīng)系統(tǒng)為主,關(guān)于其機(jī)制目前尚不清楚。
　　紋狀體作為基底節(jié)最大的綜合處理元件,包含著大量的多巴胺能神經(jīng)元,在整個(gè)腦部中的多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)含量最高。在多巴胺能系統(tǒng)神經(jīng)通路中多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)首先在突觸前膜中進(jìn)行合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、釋放、降解,以達(dá)到突出間隙中多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的平衡,突

3、觸間隙中的多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)入突觸后膜發(fā)揮突觸后效應(yīng),而多巴胺相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在整個(gè)過程中發(fā)揮著重要作用,維持突觸間隙中多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的平衡,當(dāng)該平衡被打破后神經(jīng)系統(tǒng)就會出現(xiàn)不同程度的病癥,主要表現(xiàn)在感覺運(yùn)動(dòng)整合、軀體平衡運(yùn)動(dòng)及學(xué)習(xí)記憶等方面。以往對ACR的人群流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)研究時(shí)所出現(xiàn)的神經(jīng)癥狀和體征,似乎很大程度上預(yù)示著與紋狀體多巴胺神經(jīng)通路中多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)平衡被打破有關(guān)。
　　但直至目前,有關(guān)丙烯酰胺影響紋狀體維持多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)平

4、衡的相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究報(bào)道較少,其具體機(jī)制仍未完全明確。因此,本研究擬通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)合,檢測丙烯酰胺對多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體、單胺囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)體及多巴胺合成酶—酪氨酸酸羥化酶的影響,探討其引起神經(jīng)毒性的可能機(jī)制,為防治丙烯酰胺中毒提供理論依據(jù)。
　　第一部分丙烯酰胺對大鼠神經(jīng)行為毒性的影響
　　目的：探討丙烯酰胺對大鼠神經(jīng)行為毒性的影響。
　　方法：健康成年雄性SD大鼠40只,體重230±20g,由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)

5、動(dòng)物中心提供,合格證號:SCXK(鄂)2010-0007號。大鼠在10h:14h明暗光循環(huán)的動(dòng)物房內(nèi),自由飲水、攝食,檢疫觀察7天后用于實(shí)驗(yàn)。將大鼠按體重隨機(jī)分為4組,分別為對照組、低劑量(20mg/kg)組、中劑量(30mg/kg)組、高劑量(40mg/kg)組,每組10只,均單籠飼養(yǎng)。按照對應(yīng)的染毒劑量對各ACR劑量組進(jìn)行灌胃染毒,對照組則灌胃給予等容量的生理鹽水,每周連續(xù)染毒5天間隔2天,總共19天,并于第0,6,13,19天稱量

6、體重并進(jìn)行步態(tài)評分,于第0,19天測定大鼠的后肢支撐力和甩尾時(shí)間。末次給藥24小時(shí)后,斷頭處死大鼠,迅速取出腦組織,用預(yù)冷PBS緩沖液洗凈,稱量大小腦重量,并于冰盤上迅速分離紋狀體、大腦皮層及小腦,并用干凈濾紙吸干置于﹣80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｈ〕龃笫笮?、肝、脾、肺、腎、睪丸等臟器,稱量重量并記錄。
　　結(jié)果：(1)在整個(gè)染毒期內(nèi)低劑量組大鼠雖然體重增長始終低于對照組,但差異無顯著性;與對照組比較,中劑量組大鼠平均體重于第19d明顯

7、降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);高劑量組大鼠平均體重于第6d、13d、19d也明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。另外,與低、中劑量組相比,高劑量組大鼠平均體重于第19d明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。(2)臟器系數(shù)顯示,高劑量組大小腦、心臟、肺臟、腎臟及睪丸臟器系數(shù)均有增加,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。(3)染毒第6d、13d、19d,與對照組比較,低、中、高劑量組步態(tài)評分均明顯升高

8、,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),且染毒結(jié)束后,其分值分別集中于1-2、2-3、3-4分之間,并呈現(xiàn)出時(shí)間—?jiǎng)┝俊?yīng)關(guān)系。另外,與低、中劑量組相比,高劑量組步態(tài)評分于第6d、13d、19d也明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。(4)染毒第19d,與對照組相比,低、中、高劑量組后肢支撐力指數(shù)均明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),且呈現(xiàn)出劑量—效應(yīng)關(guān)系。另外,與低、中劑量組相比,高劑量組后肢支撐力指數(shù)也明顯

9、增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(5)染毒第19d高劑量組的甩尾時(shí)間比對照組明顯縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　結(jié)論：ACR亞急性染毒能導(dǎo)致大鼠體重下降;大小腦、心臟、肺臟、腎臟及睪丸臟器系數(shù)增加;步態(tài)評分增高;后肢支撐力指數(shù)增加;甩尾時(shí)間縮短。具有明顯的神經(jīng)毒性,主要引起感覺運(yùn)動(dòng)功能異常。
　　第二部分丙烯酰胺對大鼠多巴胺相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mRNA和蛋白表達(dá)的影響
　　目的：探討丙烯酰胺對大鼠紋狀體多巴

10、胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(DAT)、單胺囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)體(VMAT2)和酪氨酸羥化酶(TH)mRNA表達(dá)和蛋白水平的影響。
　　方法：動(dòng)物分組及處理同第一部分。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測大腦皮層、小腦和紋狀體內(nèi)DAT、VMAT2、THmRNA表達(dá)水平,并檢測紋狀體中MAO-BmRNA表達(dá)水平;WesternBlot蛋白印跡技術(shù)檢測紋狀體內(nèi)DAT、VMAT2、TH的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：(1)大腦皮層結(jié)果顯示:與對照組比較,各劑量組VMAT2m

11、RNA表達(dá)水平均明顯降低,其中低、中劑量組分別降低了30％、29%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而高劑量組則降低了56%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。DAT、TH各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)小腦結(jié)果顯示:與對照組比較,低、中、高劑量組DAT、VMAT2、THmRNA表達(dá)均明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。(3)紋狀體結(jié)果顯示:DATmRNA表達(dá)與對照組相比,低、中、高劑量組均明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

12、P<0.01);Westernblot結(jié)果顯示,高劑量組的糖基化DAT蛋白表達(dá)明顯降低,僅為對照組的78%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對照組相比,高劑量組VMAT2mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01),VMAT2蛋白表達(dá)也顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對照組相比,高劑量組THmRNA和蛋白表達(dá)均明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對照組相比,高劑量組MAO-BmRNA表達(dá)明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

13、意義(P<0.01)。
　　結(jié)論：ACR亞急性染毒不僅會使大鼠小腦中DAT、VMAT2、THmRNA表達(dá)降低,還會使紋狀體中DAT、VMAT2、MAO-BmRNA和蛋白表達(dá)降低,THmRNA和蛋白表達(dá)增加,提示ACR亞急性染毒會導(dǎo)致多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)功能失常,引起胞質(zhì)和突觸間隙中多巴胺含量改變,從而導(dǎo)致多巴胺神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂。
　　第三部分丙烯酰胺對PC12細(xì)胞多巴胺相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的蛋白表達(dá)的影響
　　目的：探討

14、丙烯酰胺對PC12細(xì)胞中多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(DAT)、單胺囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)體(VMAT2)和酪氨酸羥化酶(TH)蛋白表達(dá)的影響。
　　方法：取對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞,分為1個(gè)對照組和6個(gè)染毒組,各染毒組ACR終濃度分別為0.1mmol/L,0.3mmol/L,0.6mmol/L,1.25mmol/L,2.5mmol/L,5mmol/L,染毒24h。用WesternBlot蛋白印跡技術(shù)檢測PC12細(xì)胞中DAT、VMAT2、TH的蛋白表達(dá)水平。<

15、br>　　結(jié)果：(1)DAT蛋白定量結(jié)果顯示:與對照組比較,0.6mmol/L和1.25mmol/L組PC12細(xì)胞中糖基化DAT明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與對照組比較,0.1mmol/L、0.6mmol/L、1.25mmol/L組非糖基化DAT也明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(2)VMAT2蛋白定量結(jié)果顯示:與對照組比較,0.6mmol/L-5mmol/L組PC12細(xì)胞中VMAT2明顯降低,差異具有統(tǒng)

16、計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與0.1mmol/L和0.3mmol/L組比較,0.6mmol/L-5mmol/L組VMAT2也降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.5或P<0.01)。(3)TH蛋白定量結(jié)果顯示:與對照組比較,2.5mmol/L、5mmol/L組PC12細(xì)胞中TH含量明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。
　　結(jié)論：ACR可以引起PC12細(xì)胞中DAT、VMAT2蛋白含量降低,同時(shí)還可以引起TH蛋白含量

17、升高,提示ACR可以引起PC12細(xì)胞中多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)功能異常。
　　綜上所述,ACR亞急性染毒能導(dǎo)致大鼠體重下降,后肢支撐力指數(shù)增加,步態(tài)評分增高,甩尾時(shí)間縮短,說明其神經(jīng)毒性作用比較明顯;其作用于小腦和紋狀體后,不僅會使大鼠小腦中DAT、VMAT2、THmRNA表達(dá)降低,還會使紋狀體中DAT、VMAT2、MAO-BmRNA和蛋白表達(dá)降低及THmRNA和蛋白表達(dá)增加。另外,ACR還能引起PC12細(xì)胞中DAT、VMAT2