Syndecan-4在椎間盤退變中生物學(xué)作用的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分退變腰椎間盤髓核組織Syndecan-4蛋白的表達(dá)
　　目的：研究 Syndecan-4在退變的腰椎間盤髓核組織中的表達(dá)，探討其與腰椎間盤退變的關(guān)系。
　　方法：收集在骨科行腰椎后路減壓手術(shù)患者的椎間盤標(biāo)本，共18例。所有標(biāo)本按照Pfirrmann椎間盤退變分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)，退變程度在Ⅳ-Ⅴ級(jí)的標(biāo)本做為椎間盤退變組，共10例。退變程度在?-Ⅲ級(jí)的標(biāo)本做為對(duì)照組，共8例。所有椎間盤標(biāo)本分為兩份，一份置入液氮罐中保存，行

2、RT-PCR檢測(cè)，另一份甲醛固定后，行組織學(xué)切片檢測(cè)。
　　結(jié)果：免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組及退變組的椎間盤組織均有 Syndecan-4蛋白的表達(dá)，但是退變組 Syndecan-4表達(dá)明顯高于對(duì)照組。退變組標(biāo)本 Syndecan-4的平均光密度值也要高于對(duì)照組標(biāo)本，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。RT-PCR結(jié)果也顯示，退變組椎間盤內(nèi)Syndecan-4的mRNA表達(dá)要明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）

3、。
　　結(jié)論：Syndecan-4在退變程度較高的椎間盤內(nèi)高表達(dá)，其可能參與椎間盤退變的過程。通過對(duì) Syndecan-4的研究，可以為將來在分子生物水平上治療腰椎間盤退變提供參考。
　　第二部分 Syndecan-4對(duì)人髓核細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　目的：研究 Syndecan-4表達(dá)的變化，對(duì)于髓核細(xì)胞形態(tài)和增殖能力，以及對(duì)髓核細(xì)胞功能的影響，為后續(xù)細(xì)胞水平的椎間盤退變機(jī)制的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：分別

4、使用構(gòu)建好的Syndecan-4過表達(dá)和Syndecan-4抑制病毒轉(zhuǎn)染人類髓核細(xì)胞株，用倒置顯微鏡對(duì)這些髓核細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，記錄細(xì)胞形態(tài)的不同變化。通過CCK-8法分別檢測(cè)不同組別細(xì)胞的增殖情況。提取細(xì)胞總 RNA和蛋白質(zhì)，通過RT-PCR和Western Blot檢測(cè)髓核相關(guān)功能因子等的mRNA和蛋白水平。
　　結(jié)果：不論在Syndecan-4過表達(dá)以及抑制情況下，髓核細(xì)胞的形態(tài)并沒有出現(xiàn)明顯的變化。CCK-8檢測(cè)顯示，Sy

5、ndecan-4的表達(dá)變化也沒有對(duì)于髓核細(xì)胞的增殖能力產(chǎn)生明顯影響。Syndecan-4過表達(dá)后，Aggrecan、Collagen II和SOX-9的蛋白和mRNA水平均降低，而Collagen X蛋白及mRNA水平則表達(dá)升高。在Syndecan-4抑制的情況下結(jié)果恰恰相反。
　　結(jié)論：Syndecan-4的表達(dá)變化并不影響髓核細(xì)胞的形態(tài)和增殖能力，但可以影響髓核細(xì)胞的功能，參與了椎間盤髓核細(xì)胞的退變過程。Syndecan-4的

6、過表達(dá)可以促進(jìn)髓核細(xì)胞的退行性改變。
　　第三部分 Syndecan-4對(duì)JNK/p53通路的影響
　　目的：研究Syndecan-4對(duì)JNK通路以及下游的p53通路的影響，以及在髓核細(xì)胞退變過程中發(fā)揮作用。
　　方法：在Syndecan-4過表達(dá)和抑制的髓核細(xì)胞株檢測(cè)JNK及pJNK蛋白的水平，以及p53蛋白及其靶基因mdm2和p21的水平。通過外源性的過表達(dá)p53以及阻斷JNK通路，抑制p53的表達(dá)，觀察髓核細(xì)胞的

7、相關(guān)功能因子的改變。
　　結(jié)果：Syndecan-4過表達(dá)能顯著增加 JNK蛋白的磷酸化水平和總表達(dá)水平，而抑制Syndecan-4則能明顯降低其表達(dá)水平。同樣地，Syndecan-4過表達(dá)后，髓核細(xì)胞中的p53蛋白及其靶基因 mdm2和 p21的表達(dá)水平明顯增加。p53過表達(dá)能顯著降低Aggrecan、Collagen II蛋白和mRNA水平。阻斷JNK通路，抑制了p53的表達(dá)，髓核細(xì)胞的相關(guān)功能因子則明顯增加。
　　結(jié)論

8、：Syndecan-4可以激活JNK信號(hào)通路，進(jìn)而激活下游的p53信號(hào)通路，促進(jìn)髓核細(xì)胞的退變。抑制JNK信號(hào)通路的活性，下調(diào)p53的表達(dá)，可以緩解髓核細(xì)胞的退變。
　　第四部分 Syndecan-4在兔椎間盤退變模型中的作用
　　目的：建立一個(gè)兔椎間盤退變模型，探討Syndecan-4在椎間盤退變中的作用，及可能存在的相關(guān)機(jī)制。
　　方法：選取正常體重成年新西蘭大白兔，使用18G套管針造模，造模成功后，分別注入Syn

9、decan-4 siRNA，Control siRNA及生理鹽水。8周后處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，進(jìn)行MRI，組織學(xué)檢查及免疫組化分析。
　　結(jié)果：退變椎間盤內(nèi)注射Syndecan-4 siRNA后，MRI檢測(cè)顯示椎間盤信號(hào)強(qiáng)度改善，明顯好于對(duì)照組（p<0.05）。免疫組化結(jié)果分析表明與對(duì)照組相比，椎間盤組織Collagen II含量明顯增加，JNK和p53陽性表達(dá)明顯減少（p<0.05）。
　　結(jié)論：椎間盤內(nèi)注射 Syndecan-4