去細(xì)胞同種椎間盤：使退變椎間盤再生的天然生物材料.pdf

1、本文主要從以下幾部分進行論述：
　　第一部分 椎間盤脫細(xì)胞方法及效果評估
　　目的：評估多種新西蘭白兔椎間盤脫細(xì)胞方法其脫細(xì)胞效果以及新西蘭白兔椎間盤經(jīng)脫細(xì)胞后生物化學(xué)性質(zhì)里力學(xué)性質(zhì)。
　　方法：我們從4月齡新西蘭白兔中收集了45例胸椎及腰椎椎間盤標(biāo)本，用作體外實驗。新西蘭白兔椎間盤周圍的肌肉組織及骨片被剔除干凈，切去軟骨終板保留髓核和纖維環(huán)，并在PBS中清洗以洗去多余的血液。處理后的椎間盤標(biāo)本立刻凍存于液氮中以備后用

2、。將標(biāo)本分為不作脫細(xì)胞處理的陰性對照組和行脫細(xì)胞組的A組以及B組。A組脫細(xì)胞方法:在37攝氏度水浴和液氮中反復(fù)溶凍5次，在2％TritonⅩ-100中浸泡24小時，在1％SDS溶液中浸泡24小時，后以200U/mlDNA酶處理2小時，處理后在PBS中清洗以洗去殘余試劑;B組脫細(xì)胞方法:在37攝氏度水浴和液氮中反復(fù)溶凍5次，在3％TritonⅩ-100中浸泡24小時，在2％SDS溶液中浸泡24小時，處理后在PBS中清洗以洗去殘余試劑.所有

3、標(biāo)本均以H&E和Alican藍染色，以免疫組織化學(xué)檢測椎間盤中Collagen typeⅠ，Collagen typeⅡ以及Aggrecan保存量，以DNeasy Blood&Kit試劑盒按生產(chǎn)商說明書處理提取DNA，用NanoDrop8000檢測DNA含量，以吸光度比色法檢測HYP含量，根據(jù)以上結(jié)果確定適宜脫細(xì)胞方案，排除不適宜組，以凍干法使標(biāo)本脫水，以質(zhì)量變化推測含水量。以SEM及TEM檢測對照組及適宜脫細(xì)胞法組的微觀結(jié)構(gòu)。將脫細(xì)胞

4、材料分為纖維環(huán)及髓核和兩部分，適用電腦控制檢測裝置以檢測纖維環(huán)彈性模量，最大張力以及最大壓力，檢測髓核壓縮模量。
　　結(jié)果：A組和對照組在H&E和Alican藍染色，各項免疫組織化學(xué)結(jié)果中無明顯差異，B組則與對照組之間存在明顯差異;A組中HYP含量最高，對照組次之，B組中HYP含量最低，且三者存在明顯差異，A組方法為適宜椎間盤脫細(xì)胞方法。A組含水量明顯高于對照組，兩者SEM以及TEM結(jié)果無明顯差異;A組與對照組的彈性模量，壓力模量

5、，最大壓力以及最大延長度均無明顯差異。
　　結(jié)論：在37攝氏度水浴和液氮中反復(fù)溶凍5次，在2％TritonⅩ-100中浸泡24小時，在1％SDS溶液中浸泡24小時，后以200U/mlDNA酶處理2小時，處理后在PBS中清洗以洗去殘余試劑是新西蘭白兔適宜的椎間盤脫細(xì)胞方法。這種方法可以最大程度上的保留椎間盤原有的生物化學(xué)特點，微觀結(jié)構(gòu)以及力學(xué)特點。
　　第二部分 同種去細(xì)胞椎間盤材料安全性評估
　　目的：評估同種去細(xì)胞椎

6、間盤材料分別在體內(nèi)及體外的安全性。
　　方法：為評估同種去細(xì)胞椎間盤材料分別在體內(nèi)及體外的安全性，我們將新西蘭白兔椎間盤標(biāo)本分為實驗組及對照組，實驗組按第一部分中得出的適宜的椎間盤脫細(xì)胞方法進行處理，對照組不予處理，分別植入新西蘭白兔脊柱兩側(cè)皮下，1月后去除實驗組及對照組，所有標(biāo)本均以HE染色觀察中性粒細(xì)胞分布，以免疫組織化學(xué)檢測MAC387及CD8水平觀察巨噬細(xì)胞及細(xì)胞毒T細(xì)胞水平。以梯度離心法收集新西蘭白兔MSC，將去細(xì)胞椎間

7、盤材料置于DMEM-HG中，放置于培養(yǎng)箱48小時，收集浸提液，將MSC培養(yǎng)于含F(xiàn)BS10％的DEME-HG(對照組)，25％浸提液+DMEM-HG，50％浸提液+DMEM-HG和100％浸提液中培養(yǎng)，以活死細(xì)胞染色觀察存活細(xì)胞，以CCK-8試劑盒及吸光度比色計觀察細(xì)胞活力。將MSC種植按第一部分方法脫細(xì)胞的新西蘭白兔椎間盤材料上，分別在第3天，第7天，第14天，第21天以活死細(xì)胞染色觀察存活細(xì)胞，以H&E染色觀測材料結(jié)構(gòu)以及MSC分布。

8、
　　結(jié)果：經(jīng)第一部分適宜脫細(xì)胞方法處理后的新西蘭白兔椎間盤材料在植入同種白兔皮下后未見明顯中性粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，細(xì)胞毒性T細(xì)胞浸潤;未經(jīng)第一部分適宜脫細(xì)胞方法處理后的新西蘭白兔椎間盤材料在植入同種白兔皮下后出現(xiàn)明顯中性粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，細(xì)胞毒性T細(xì)胞浸潤并出現(xiàn)明顯血管生長;FBS10％的DEME-HG(對照組)，25％浸提液+DMEM-HG，50％浸提液+DMEM-HG和100％浸提液這四組在活細(xì)胞數(shù)計數(shù)以及細(xì)胞活性無明顯差異。

9、MSC能在經(jīng)第一部分適宜脫細(xì)胞方法處理后的新西蘭白兔椎間盤材料生長，擴增以及遷移。
　　結(jié)論：經(jīng)第一部分適宜脫細(xì)胞方法處理后的新西蘭白兔椎間盤材料不會引起宿主產(chǎn)生明顯的炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，無體內(nèi)毒性。材料浸出液及材料對MSC無明顯毒性，不影響MSC增殖及遷移，不影響MSC細(xì)胞活力。
　　第三部分 驗證脫細(xì)胞椎間盤材料的修復(fù)作用
　　目的：驗證脫細(xì)胞椎間盤能在體外誘導(dǎo)MSC向椎間盤樣細(xì)胞分化，并且能夠在體內(nèi)試

10、驗中有效阻止椎間盤的退變。
　　方法：通過掃描電鏡(SEM)觀察于體外植入脫細(xì)胞椎間盤材料后MSC的形態(tài)變化，并且用RT-PCR的方法測定MSC中椎間盤細(xì)胞相關(guān)基因（包括ColⅡ，ColⅠ，SOX-9，GPC3，AGN)的表達情況，來判斷MSC是否向椎間盤樣細(xì)胞分化。體外實驗部分使用新西蘭大白兔，用針穿刺椎間盤制造椎間盤退變模型。L3-L4為陰性對照組，造模后注入生理鹽水;L4-L5為實驗組，造模后植入脫細(xì)胞椎間盤顆粒;L5-L6

11、為空白對照組。然后分別觀察0、1、2、3月份的椎間盤含水量以及椎間盤高度。H&E染色、阿爾新藍染色觀察椎間盤微觀結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果：SEM顯示植入MSC的脫細(xì)胞椎間盤內(nèi)可觀察到椎間盤樣細(xì)胞，且RT-PCR結(jié)果顯示植入后的MSC較平板培養(yǎng)的MSC椎間盤細(xì)胞相關(guān)基因表達上調(diào)，如Ⅱ型膠原(ColⅡ)、蛋白多糖(AGN)、SOX-9和GPC3，而軟骨相關(guān)基因Ⅰ型膠原(ColⅠ)表達不增加。
　　體內(nèi)試驗部分，實驗組與陰性對照組組相比保