IL-17A在退變椎間盤炎癥反應(yīng)及股骨頭壞死軟骨退變中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、本研究分為三部分:第一部分旨在研究IL-17A和COX2在椎間盤組織及髓核細(xì)胞中表達(dá);第二部分旨在研究IL-17A對(duì)髓核細(xì)胞致炎作用的相關(guān)機(jī)制;第三部分為IL-17A在股骨頭壞死軟骨退變中的作用及機(jī)制研究
　　第一部分:IL-17A和COX2在椎間盤組織及髓核細(xì)胞中表達(dá)的研究
　　研究目的:檢測(cè)椎間盤突出癥患者椎間盤組織中Th17相關(guān)細(xì)胞因子IL-17A及疼痛相關(guān)因子COX2的表達(dá)，研究髓核細(xì)胞中IL-17A對(duì)COX2及其下

2、游分子PGE2的作用。
　　研究方法:選取2014年2月-2015年4月于山東大學(xué)齊魯醫(yī)院住院行手術(shù)治療的腰椎間盤突出癥患者56例為實(shí)驗(yàn)組，以及行手術(shù)治療的脊柱外傷患者8例為對(duì)照組。取患者術(shù)中切除的部分腰椎間盤組織，通過免疫組織化學(xué)法檢測(cè)2組患者椎間盤組織中的IL-17A和COX-2的表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn):選擇11例腰椎間盤突出癥患者髓核組織提取原代髓核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，取第三代髓核細(xì)胞加入IL-17A進(jìn)行培養(yǎng)，設(shè)置IL-17A濃度梯度及時(shí)

3、間梯度，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)PGE2的濃度，收集髓核細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，通過蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western Blot)檢測(cè)髓核細(xì)胞中COX2的表達(dá)情況。
　　研究結(jié)果:1.免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組患者椎間盤組織中IL-17A及COX-2均有表達(dá)，表達(dá)水平較對(duì)照組明顯提高，并存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。
　　2.IL-17A刺激原代髓核細(xì)胞后，能夠明顯提高髓核細(xì)胞中COX-2和

4、PGE2的表達(dá)，并存在明顯的濃度依賴性和時(shí)間依賴性。
　　研究結(jié)論:IL-17A能夠誘導(dǎo)COX2和PGE2的表達(dá)。在多種疾病中，COX2和PGE2在炎癥過程及疼痛中扮演重要角色，而COX2是PGE2合成的關(guān)鍵性限速酶，IL-17A可能通過誘導(dǎo)COX-2的表達(dá)，進(jìn)一步導(dǎo)致PGE2生成，從而在退變腰椎間盤炎癥反應(yīng)及腰背部疼痛中發(fā)揮重要作用。
　　第二部分:IL-17A對(duì)髓核細(xì)胞致炎作用相關(guān)機(jī)制的研究
　　研究目的:研究IL

5、-17A對(duì)髓核細(xì)胞中MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和轉(zhuǎn)錄因子AP-1的作用，探討MAPK信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子AP-1在IL-17A誘導(dǎo)的COX2和PGE2表達(dá)中的調(diào)控機(jī)制。
　　研究方法:使用體外培養(yǎng)的原代髓核細(xì)胞，加入濃度為100ng/ml的IL-17A進(jìn)行刺激，western blot檢測(cè)不同時(shí)間內(nèi)p38 MAPK、JNK MAPK、ERK1/2 MAPK的活化表達(dá)情況;用IL-17A分別刺激p38、JNK、ERK1/2信號(hào)通路抑制劑預(yù)處

6、理髓核細(xì)胞，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中PGE2的濃度，提取髓核細(xì)胞總蛋白，western blot檢測(cè)COX2的表達(dá)情況;用IL-17A刺激原代髓核細(xì)胞以及p38MAPK、JNK MAPK抑制劑處理后的髓核細(xì)胞，免疫熒光檢測(cè)髓核細(xì)胞中磷酸化c-jun的表達(dá)情況，提取細(xì)胞核蛋白，western blot檢測(cè)c-jun和c-fos的表達(dá);用IL-17A刺激AP-1抑制劑預(yù)處理的髓核細(xì)胞，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中PGE2的濃度，

7、Western blot檢測(cè)COX-2的表達(dá)情況。
　　研究結(jié)果:1.IL-17A可刺激髓核細(xì)胞激活p38 MAPK和JNK MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在原代髓核細(xì)胞中，IL-17A能夠迅速誘導(dǎo)P38 MAPK和JNK MAPK的磷酸化，隨著時(shí)間延長，二者磷酸化水平逐漸降低，但是IL-17A刺激不能導(dǎo)致ERK1/2 MAPK的磷酸化。
　　2.p38 MAPK和JNK MPAK抑制劑可顯著抑制IL-17A誘導(dǎo)的COX2和PGE2

8、的表達(dá)，Western blot和ELISA結(jié)果分別顯示，p38 MAPK和JNK MAPK抑制劑單一使用和聯(lián)合使用，均能顯著降低COX2和PGE2的表達(dá)，但是ERK1/2 MAPK抑制劑對(duì)COX2和PGE2的表達(dá)無明顯影響。這說明，IL-17A通過激活p38 MAPK和JNK MAPK信號(hào)通路而上調(diào)COX2和PGE2的表達(dá)，以發(fā)揮其致炎作用。我們還發(fā)現(xiàn)，p38 MAPK和JNK MAPK抑制劑二者單一使用時(shí)，均可導(dǎo)致COX2和PGE2

9、的表達(dá)下降80％以上，一條通路被阻斷的效果并不能夠被另一條的激活所代償，這說明P38 MAPK和JNK MAPK二者相互獨(dú)立，IL-17A發(fā)揮作用需二者的同時(shí)激活，這可能與下游的轉(zhuǎn)錄因子活化有關(guān)。
　　3.對(duì)MAPK信號(hào)通路下游轉(zhuǎn)錄因子AP-1進(jìn)行研究，免疫熒光結(jié)果顯示，未處理的髓核細(xì)胞中，c-jun磷酸化水平較低，IL-17A刺激后，髓核細(xì)胞中c-jun的磷酸化水平明顯增高，而JNK抑制劑可阻斷IL-17A誘導(dǎo)的c-jun磷酸化

10、;western blot結(jié)果表明，IL-17A能夠顯著激活c-jun和c-fos二者在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)，加入MAPK抑制劑后，p38 MAPK抑制劑可抑制c-fos的細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，但對(duì)c-jun無明顯影響，而JNK MAPK的抑制劑可以抑制c-jun的核內(nèi)表達(dá)，但對(duì)c-fos無影響。
　　4.AP-1抑制劑可阻斷IL-17A上調(diào)COX2和PGE2表達(dá)的作用，這說明IL-17A對(duì)髓核細(xì)胞的作用，有賴于轉(zhuǎn)錄因子AP-1的活化。

11、　　研究結(jié)論:1.IL-17A可以激活P38 MAPK和JNK MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路;
　　2.IL-17A誘導(dǎo)COX2和PGE2的表達(dá)有賴于P38 MAPK和JNK MAPK信號(hào)通路的激活，并且，p38 MAPK和JNK MAPK信號(hào)通路需同時(shí)激活，IL-17A方可發(fā)揮其致炎作用。
　　3.IL-17A可以誘導(dǎo)髓核細(xì)胞內(nèi)c-jun的磷酸化，并上調(diào)c-fos和c-jun在髓核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，這證明了IL-17A可以激活髓核細(xì)胞

12、中轉(zhuǎn)錄因子AP-1的表達(dá)。
　　4.在髓核細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄因子AP-1參與了IL-17A上調(diào)COX2蛋白的表達(dá)及其下游產(chǎn)物PGE2的表達(dá)過程。
　　5.IL-17A在髓核細(xì)胞內(nèi)可通過誘導(dǎo)P38 MAPK磷酸化，上調(diào)c-fos在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)，通過誘導(dǎo)JNK MAPK的磷酸化，而上調(diào)c-jun磷酸化和表達(dá)，c-fos和c-jun組成c-fos/c-jun異源二聚體而形成活化的轉(zhuǎn)錄因子AP-1，從而激活COX2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)P

13、GE2的產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)髓核細(xì)胞炎癥反應(yīng)。
　　6.IL-17A通過p38/c-fos和JNK/c-jun途徑激活轉(zhuǎn)錄因子AP-1，從而上調(diào)COX2的表達(dá)和PGE2的生成，從而在椎間盤組織中發(fā)揮致炎作用。
　　第三部分: IL-17A在股骨頭壞死軟骨退變中的作用及機(jī)制研究
　　研究目的:研究股骨頭壞死髖關(guān)節(jié)液中炎癥介質(zhì)IL-17A的表達(dá)，及壞死股骨頭軟骨組織中ADAMTS-7的表達(dá)與軟骨退交情況的關(guān)系，并探討IL-17A

14、對(duì)ADAMTS-7表達(dá)的影響及可能作用機(jī)制。
　　研究方法:選取于山東大學(xué)齊魯醫(yī)院住院行手術(shù)治療的股骨頭壞死患者34例為實(shí)驗(yàn)組，及股骨頸骨折患者14例為對(duì)照組。使用ELISA法檢測(cè)股骨頭壞死患者關(guān)節(jié)液中IL-17A的表達(dá)情況;HE染色和番紅固綠染色評(píng)價(jià)軟骨退變情況;免疫組織化學(xué)染色研究ADAMTS-7和p-NFκB p65的表達(dá)水平;提取原代軟骨細(xì)胞，加入IL-17A刺激后，檢測(cè)軟骨細(xì)胞中ADAMTS-7的表達(dá)水平及NFκB p6

15、5的活化水平。
　　研究結(jié)果:1.股骨頭壞死髖關(guān)節(jié)液ELISA結(jié)果顯示，股骨頭壞死關(guān)節(jié)液中IL-17A含量明顯增加。
　　2.軟骨HE染色和番紅-固綠染色結(jié)果顯示ONFH患者股骨頭軟骨隨病情進(jìn)展逐漸發(fā)生退行性改變。
　　3.免疫組織化學(xué)、Western Blot和RT-PCR結(jié)果顯示，ONFH股骨頭軟骨中ADAMTS-7的轉(zhuǎn)錄表達(dá)均明顯增加，同時(shí)，Western Blot結(jié)果顯示隨著股骨頭壞死患者軟骨組織中COMP降解

16、增加。
　　4.免疫組織化學(xué)顯示ONFH患者軟骨組織中磷酸化NF-κB P65表達(dá)增加，IL-17A可誘導(dǎo)軟骨原代細(xì)胞中ADAMTS-7的表達(dá)，同時(shí)激活NF-κB P65。
　　研究結(jié)論:1.股骨頭壞死患者髖關(guān)節(jié)液中IL-17A含量增加;
　　2.壞死股骨頭軟骨組織中ADAMTS-7表達(dá)增加，并可能通過降解軟骨基質(zhì)中COMP導(dǎo)致軟骨退變;
　　3.IL-17A可能通過激活NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞表達(dá)AD