感染、缺血等損傷對腰椎終板及腰椎間盤退變的影響及機制的研究.pdf

1、背景：
　　作為人體中軸骨的主要承重結構，腰椎在脊柱的各項活動中常需處于壓縮、拉伸、側彎或扭曲等多種復雜的運動狀態(tài)中，其損傷及退變是人群常見的疾病之一，約60％成人及30％青少年有下腰痛(LBP)病史。既往研究顯示下腰痛與椎間盤退行性疾病密切相關，而近年來的研究則提出腰椎終板Modic改變是LBP的危險因素。Modic改變根據(jù)MRI信號變化將退變終板分為3種亞型:Ⅰ型Modic改變表現(xiàn)為終板在T1像上信號降低，T2像信號增高，提示

2、急性炎癥，骨組織輕微損傷及微骨折;Ⅱ型Modic改變表現(xiàn)為T1及T2像信號均增高，提示終板損傷、炎性改變及組織脂肪變;Ⅲ型Modic改變則表現(xiàn)為終板區(qū)域信號在T1及T2像均減低，提示區(qū)域骨化。Modic改變的人群整體發(fā)病率約為5.8％，其發(fā)生率及影響面積隨年齡增大而升高，以單純Ⅱ型Modic改變最為多見(64.2％)，其次為Ⅰ/Ⅱ型混合(18.1％)及單純Ⅰ型(16％)。絕大部分Modic改變均發(fā)生于下腰椎位置（L4/L5及L5/S1，

3、83％），其在椎間盤的上/下終板之間分布并無顯著差異，且77.9％的Modic改變在同一椎間盤的上/下方成對出現(xiàn)。
　　有關Modic改變的成因現(xiàn)存有多種理論，其中最為經(jīng)典的是力學損傷機制。椎體終板是腰椎解剖結構的薄弱部位，因此傳統(tǒng)理論認為椎間盤內應力可集中于終板，致使終板發(fā)生退變。終板的部分區(qū)域應力集中的發(fā)生可引發(fā)終板裂隙，終板下部分區(qū)域骨質逐漸鈣化，而Modic改變則反映了相應的急性出血水腫（Ⅰ型）-慢性炎癥修復（Ⅱ型）-區(qū)域

4、骨化（Ⅲ型）的進程。Modic改變的另一種病變機制可能涉及營養(yǎng)方面因素，研究顯示維生素D攝入量與Modic改變發(fā)生率之間存在正相關，其可能與維生素D對鈣離子代謝的影響相關。而吸煙及高血脂引起的血管功能障礙亦被認為與Modic改變發(fā)生率呈正相關。此外，近年來痤瘡丙酸桿菌(P.acnes)感染與Modic改變引起了廣泛的爭議及研究。P.acnes的出現(xiàn)與Modic改變的發(fā)生高度相關，而雙盲病例對照研究顯示抗生素治療對伴有Ⅰ型Modic改變的

5、腰背痛患者具有較好的治療效果。
　　本研究的興趣在于進一步研究Modic改變的發(fā)生機制，在細胞培養(yǎng)，動物模型兩個層面分別觀察低毒性細菌感染及組織缺血對腰椎間盤及其相鄰終板結構的影響，通過影像學，分子生物學及病理學手段進行評估。
　　目的：
　　通過體外細胞培養(yǎng)及動物模型研究，了解骨性終板區(qū)感染、缺血等損傷對腰椎間盤及終板的影響，探究其損傷機制，進而探索相應病因下治療或預防椎間盤疾病的新策略。
　　方法：
　

6、　1.獲取大鼠椎間盤髓核細胞及終板細胞進行體外培養(yǎng)，給予不同的刺激(P.acnes細菌上清液，缺氧生長環(huán)境或血管生長抑制劑)觀察細胞生長情況，并收集細胞進行基因表達和細胞活性檢測。
　　2.構建經(jīng)肌間隙開放手術入路的兔腰椎間盤髓核穿刺通道，并以此通道注射痤瘡丙酸桿菌建立相應動物模型。收集標本進行影像學檢查，基因表達，分子生物學測試，病理學檢測等。
　　3.構建兔腰椎間盤終板下穿刺通道，并以此通道注射痤瘡丙酸桿菌或博來霉素（血

7、管抑制劑）建立相應動物模型。收集標本進行影像學檢查，基因表達，分子生物學測試，病理學檢測等評估模型。
　　結果：
　　1.低毒性細菌感染或缺氧對椎間盤細胞的刺激作用
　　1.1、低毒性細菌感染抑制髓核及終板細胞的生長
　　細胞培養(yǎng)結果顯示，當共培養(yǎng)的細菌上清液濃度大于4*106 CFU/mL時，髓核細胞發(fā)生大量死亡;當濃度小于2.5*105 CFU/mL時，髓核細胞生長受到明顯抑制。當共培養(yǎng)的細菌上清液濃度大于2

8、*106 CFU/mL時，終板軟骨細胞發(fā)生大量死亡;當濃度小于5*105 CFU/mL時，終板軟骨細胞生長受到明顯抑制。
　　1.2、低毒性細菌感染刺激髓核及終板細胞炎癥反應基因的表達
　　基因表達結果顯示一定濃度的P.acnes上清液刺激可顯著提高髓核及終板細胞的細胞外基質降解相關基因如MMP-9、ADAMTSs等的表達，同時下調細胞外基質，如蛋白聚糖、膠原蛋白等的表達水平。
　　1.3、血管生長抑制劑博來霉素對健康

9、終板細胞無顯著損傷作用
　　使用62.5μg/ml血管生長抑制劑博來霉素培養(yǎng)正常終板細胞48小時后，終板細胞存活率及活性與對照組相比沒有統(tǒng)計學差異;細胞產物表達（Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、蛋白聚糖等）與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。
　　1.4、缺氧環(huán)境對髓核及終板細胞的刺激作用
　　細胞培養(yǎng)結果顯示，終板細胞在缺氧（5％二氧化碳，3％氧分壓）環(huán)境下增殖速度減慢約40％，細胞代謝水平降低，無氧代謝產物增加，細胞活性下降;膠原及

10、蛋白聚糖等細胞外加基質合成減少，同時降解基質的MMPs及ADAMTSs表達增加。髓核細胞在缺氧環(huán)境中活性未見明顯變化，僅有HIF-1α及ADAMTS-5表達上調。
　　2.腰椎間盤內低毒性細菌感染對在體腰椎終板及髓核的影響
　　2.1、腰椎間盤內低毒性細菌感染引發(fā)顯著的的終板區(qū)域及椎間盤MRI退變表現(xiàn)
　　通過開放手術經(jīng)側方肌間隙入路暴露椎間盤并進行穿刺，椎間盤內注射P.acnes后，可發(fā)現(xiàn)在術后2周時即有椎間盤信號降

11、低表現(xiàn)。至術后9月時，幾乎所有實驗椎間盤均發(fā)生不同程度退變。術后3月有部分節(jié)段終板區(qū)域發(fā)生Ⅰ型Modic改變，并在術后6月開始部分轉變?yōu)棰蛐蚆odic改變。
　　2.2、腰椎間盤內低毒性細菌感染引發(fā)的椎間盤基質降解及終板區(qū)域炎癥反應
　　P.acnes椎間盤內感染可顯著增加椎間盤組織中細胞外基質（如蛋白聚糖等）的分解，同時引發(fā)的炎癥反應破壞了終板軟骨結構，進一步促進了椎間盤的退變。qPCR顯示髓核內前炎癥因子如IL-1β、T

12、NF-α、IFN-γ及基質降解酶MMP-9、ADAMTS-5表達顯著上調，同時終板區(qū)域IL-1β、TNF-α及ADAMTS-5表達量顯著升高。提示P.acnes感染引起了較為劇烈的椎間盤及終板區(qū)域炎性反應。
　　2.3、腰椎間盤內低毒性細菌感染與終板下骨質的吸收與重構
　　P.acnes感染椎間盤內后9月，終板骨結構發(fā)生明顯骨吸收樣改變，骨小梁較為稀疏，骨密度顯著降低，骨相對體積顯著降低而BS/BV顯著升高，骨小梁厚度明顯降

13、低。病理切片亦顯示在部分區(qū)域可見終板區(qū)域異位骨化增生情況。
　　3.腰椎終板區(qū)低毒性細菌感染及血管抑制對在體腰椎終板及髓核的損傷作用
　　3.1、腰椎終板區(qū)低毒性細菌感染引發(fā)的終板區(qū)域及髓核MRI影像學變化
　　通過X線透視下經(jīng)皮穿刺椎間盤終板下骨，并經(jīng)該通道注射P.acnes后，可發(fā)現(xiàn)在術后6月均無顯著椎間盤退變表現(xiàn)。在術后6月時，約1/3椎體鄰近終板區(qū)域發(fā)生T1及T2像MRI信號升高表現(xiàn)，提示發(fā)生Ⅱ型Modic改變

14、。
　　3.2、腰椎終板區(qū)低毒性細菌感染誘發(fā)炎癥損傷
　　P.acnes終板下感染時，終板下骨內前炎癥因子如IL-1β、TNF-α、IFN-γ等表達顯著升高，提示P.acnes感染引起的溫和而慢性的終板區(qū)域炎癥樣反應。同一時間內，椎間盤內部并無顯著炎癥因子上升或炎性反應表現(xiàn)。
　　3.3、腰椎終板區(qū)低毒性細菌感染作用下的骨結構改變
　　病理切片及Micro-CT檢查結果顯示，相比直接感染椎間盤內而言，終板下骨區(qū)域

15、P.acnes感染并無明顯終板骨性結構重塑反應，終板下骨僅可見輕度骨吸收反應。同時，病理檢查顯示部分樣本（3例）可見終板裂隙。
　　3.4、抑制血管生成在終板區(qū)域引發(fā)的終板區(qū)域MRI影像學變化
　　通過X線透視下經(jīng)皮穿刺椎間盤終板下骨，并經(jīng)該通道注射博來霉素抑制血管生成后，可發(fā)現(xiàn)在術后6月均無顯著椎間盤退變表現(xiàn)。在術后2月、3月及6月時，約1/3椎體鄰近終板區(qū)域發(fā)生T1及T2像MRI信號降低表現(xiàn)，提示發(fā)生Ⅲ型Modic改變，

16、即終板區(qū)域骨化表現(xiàn)。
　　3.5、抑制血管生成在終板區(qū)域誘發(fā)的骨結構改變
　　對實驗動物終板下骨Micro-CT掃描結果顯示骨小梁結構稀疏，但厚度增加，BMD升高，骨相對體積增加，提示終板下骨區(qū)域發(fā)生區(qū)域部分吸收，同時在大范圍內發(fā)生骨化反應。終板下骨內炎癥因子如IL-1β、TNF-α表達升高。
　　結論：
　　1.低毒性細菌上清液在髓核及軟骨終板細胞體外培養(yǎng)時可顯著抑制細胞生長，下調細胞外基質蛋白表達水平，同時上

17、調基質降解酶，如MMPs、ADAMTSs的表達。同時，髓核細胞在缺氧環(huán)境下增殖速度減緩，代謝水平降低，細胞外基質合成減少而降解增加。血管抑制劑博來霉素在體外培養(yǎng)時并沒有顯著細胞毒性，不會損害髓核細胞及終板細胞的活性及代謝水平。
　　2.低毒性細菌直接感染腰椎間盤可在術后3-9月引發(fā)時間依賴性的終板Modic改變及椎間盤退變，激活髓核及終板內IL-1β、TNF-α、IFN-γ等多條炎癥通路，并促使終板下骨結構發(fā)生骨吸收及骨重構改變。