環(huán)狀RNA CDK13在前列腺癌中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、CircRNA是由pre-mRNA通過可變剪切加工產(chǎn)生的一類相對穩(wěn)定的保守性產(chǎn)物，在人體細(xì)胞中廣泛表達(dá)，近年研究發(fā)現(xiàn)，circRNA具有很多重要的調(diào)控功能，例如，circRNA可以作為miRNA海綿競爭性結(jié)合胞內(nèi)miRNA，阻斷miRNA對其靶基因的抑制作用，從而調(diào)控miRNA靶標(biāo)發(fā)揮作用。除此以外，circRNA也可與RNA結(jié)合蛋白(RNA-binding protein， RBP)結(jié)合，或者與其他RNA通過堿基互補(bǔ)配對發(fā)揮作用。隨著

2、研究的深入，circRNA影響腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展得到越來越多的研究人員認(rèn)同。目前， circRNA在胃癌、肝癌、喉癌、基底細(xì)胞癌、大腸癌、白血病中的作用都有所報(bào)道。然而，關(guān)于circRNA在前列腺癌中的作用尚未有過報(bào)道。本課題組前期實(shí)驗(yàn)表明，環(huán)狀RNA CDK13（circCDK13）在前列腺癌中表達(dá)顯著高于癌旁組織及前列腺增生組織，我們猜測其可能具有促癌作用，本研究就circCDK13在前列腺癌中的作用及其機(jī)制進(jìn)行研究，為前列腺癌的防治

3、提供理論基礎(chǔ)。
　　第一部分環(huán)狀RNA CDK13在前列腺癌中的表達(dá)及其功能
　　目的：
　　探討circCDK13在前列腺癌中的表達(dá)及其對前列腺癌細(xì)胞的增殖的影響。
　　方法：
　　1利用circRNA微陣列芯片分析前列腺癌和相對應(yīng)的癌旁非腫瘤標(biāo)本，篩選出明顯表達(dá)異常的circRNA，qRT-PCR驗(yàn)證其結(jié)果。
　　2設(shè)計(jì)針對circRNA反向剪接位點(diǎn)的背靠背引物，擴(kuò)增后用瓊脂糖凝膠電泳和桑格測序驗(yàn)

4、證。
　　3熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)觀察前列腺癌和癌旁組織circCDK13表達(dá)量。
　　4過表達(dá)或敲低circCDK13，qRT-PCR檢測其表達(dá)量變化，劃痕實(shí)驗(yàn)觀察其增殖能力。
　　5過表達(dá)或敲低circCDK13，Western blot檢測周期相關(guān)蛋白變化。
　　結(jié)果：
　　1前列腺癌組織中circCDK13表達(dá)明顯高于癌旁組織
　　利用circRNA微陣列芯片分析了3組前列腺癌和相對應(yīng)的癌旁非腫瘤標(biāo)

5、本，發(fā)現(xiàn)多種circRNA在前列腺癌組織表達(dá)異常，這里列出其中8個(gè)升高的circRNA（hsa_circ_40578、hsa_circ_0001212、hsa_circ_0051239、hsa_circ_0002082、hsa_circ_0000517、hsa_circ_0001982、hsa_circ_0079929、hsa_circ_0054971）；和7個(gè)表達(dá)下降的circRNA（hsa_circ_0001296、hsa_circ

6、_0000350、hsa_circ_0003748、hsa_circ_0001255、hsa_circ_0079385、hsa_circ_0001605、hsa_circ_0092360）。在這些表達(dá)異常的circRNA中，我們進(jìn)一步通過qRT-PCR檢測這些環(huán)狀RNA在組織中的表達(dá)，證實(shí)hsa_circ_0079929在前列腺癌組織中的表達(dá)顯著上調(diào)。該環(huán)狀RNA來源于CDK13基因。
　　2鑒別和驗(yàn)證circCDK13為環(huán)形RN

7、A
　　為了進(jìn)一步驗(yàn)證 circCDK13為環(huán)形RNA，我們設(shè)計(jì)了針對circCDK13反向剪接結(jié)合位點(diǎn)的引物，分別以互補(bǔ)DNA（cDNA）和基因組DNA（gDNA）為模板進(jìn)行RT-PCR，繼而用瓊脂糖凝膠電泳鑒定RT-PCR產(chǎn)物，以cDNA為模板的RT-PCR產(chǎn)物中可以擴(kuò)增出circRNA連接處的DNA片段，而以gDNA為模板組則無明顯條帶。桑格測序?qū)嶒?yàn)證實(shí)circCDK13的反向剪接位點(diǎn)。RT-PCR擴(kuò)增circCDK13，瓊

8、脂糖凝膠電泳鑒定其分子量為660bp。
　　3 circCDK13在前列腺癌和癌旁組織的定位和表達(dá)
　　為了進(jìn)一步確認(rèn)circCDK13的表達(dá)量，我們用包含綠色熒光標(biāo)簽的circCDK13進(jìn)行熒光原位雜交，結(jié)果表明前列腺癌中circCDK13表達(dá)明顯高于癌旁組織，與circCDK13微陣列芯片和qRT-PCR結(jié)果一致。
　　4過表達(dá)和敲低circCDK13分別促進(jìn)或抑制體外培養(yǎng)的PC3細(xì)胞增殖
　　為了驗(yàn)證cir

9、cCDK13的生物學(xué)功能，我們構(gòu)建了包含有環(huán)狀RNA環(huán)化結(jié)構(gòu)和circCDK13序列的質(zhì)?！狦FP-circCDK13和訂購了直接靶向circCDK13連接處的小干擾RNA—si-circCDK13，分別過表達(dá)和敲低circCDK13， qRT-PCR驗(yàn)證circCDK13表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染GFP-circCDK13后，circCDK13表達(dá)增加，轉(zhuǎn)染si-circCDK13后，circCDK13表達(dá)量下降，證實(shí)我們構(gòu)建的GFP-circ

10、CDK13和設(shè)計(jì)的si-circCDK13的可靠性。既然circCDK13在前列腺癌組織中高表達(dá)，那么它是否會促進(jìn)體外培養(yǎng)的PC3細(xì)胞的增殖呢？為了驗(yàn)證此假說，我們做了細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，過表達(dá)circCDK13顯著增加PC3細(xì)胞的增殖遷移能力，敲低circCDK13顯著抑制了PC3細(xì)胞的增殖遷移能力。
　　5 circCDK13通過調(diào)控細(xì)胞周期影響腫瘤細(xì)胞增殖
　　為了闡明circCDK13促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)

11、制，我們用Western blot檢測了細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白，包括CDK4、CDK13、cyclinD1蛋白的表達(dá)。在前列腺癌細(xì)胞中過表達(dá)circCDK13顯著上調(diào)CDK4、CDK13、cyclinD1表達(dá)。相反，與轉(zhuǎn)染對照siRNA相比，前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-circCDK13后，CDK4、CDK13、cyclinD1蛋白的表達(dá)水平顯著下降。以上結(jié)果表明，前列腺癌細(xì)胞中過表達(dá)的circCDK13通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。

12、>　　小結(jié)：circCDK13在前列腺組織中表達(dá)，并且其在前列腺癌組織中的表達(dá)明顯高于前列腺增生組織，過表達(dá)circCDK13可促進(jìn)PC3細(xì)胞增殖，敲低circCDK13則抑制PC3細(xì)胞增殖，circCDK13通過調(diào)控細(xì)胞周期影響腫瘤細(xì)胞增殖。
　　第二部分環(huán)狀RNA CDK13通過吸附miR-212-5p/449a激活E2F5信號途徑促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖
　　目的：
　　揭示環(huán)狀RNA CDK13通過吸附miR-21

13、2/449a進(jìn)而激活靶基因E2F5在前列腺癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1 qRT-PCR檢測前列腺癌及癌旁組織相應(yīng)miRNA變化。生物信息學(xué)技術(shù)分析circCDK13上miR-212-5p和miR-449a潛在的結(jié)合位點(diǎn)。生物素標(biāo)記circCDK13后，轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞，oligo-pulldown并利用 qRT-PCR檢測富集的circCDK13。熒光報(bào)告基因檢測circCDK13與miRNA是否結(jié)合。
　

14、　2基因芯片分析前列腺癌和相對應(yīng)的癌旁非腫瘤標(biāo)本，篩選出明顯表達(dá)異常的基因，qRT-PCR驗(yàn)證其結(jié)果。
　　3信息學(xué)技術(shù)預(yù)測E2F5上miR-212-5p和miR-449a潛在的結(jié)合位點(diǎn)。合成靶基因3'非編碼序列（UTR）及其突變體并連接到pmir-GLO雙熒光報(bào)告質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞并進(jìn)行雙熒光報(bào)告基因活性檢測。熒光原位雜交聯(lián)合免疫熒光試驗(yàn)觀察前列腺癌和癌旁組織中circCDK13和E2F5的表達(dá)量變化及定位。
　　4過

15、表達(dá)E2F5 qRT-PCR檢測環(huán)狀和線狀CDK13 RNA的變化。過表達(dá)E2F5 Western blot檢測CDK13及周期相關(guān)蛋白的變化。熒光報(bào)告基因檢測E2F5與CDK13的相互作用。
　　5利用慢病毒轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞并獲得穩(wěn)定表達(dá)circCDK13的細(xì)胞株，裸鼠荷瘤觀察腫瘤生長變化，Western blot檢測E2F5和增殖相關(guān)的PCNA的表達(dá)。熒光原位雜交觀察腫瘤中E2F5、PCNA和P21的表達(dá)。
　　結(jié)果：

16、r>　　1 circCDK13可以吸附miR-212-5p/449a，使其在前列腺癌中的表達(dá)減少
　　為了確定circCDK13與哪些miRNAs相互作用，我們首先用qRT-PCR分析了四種miRNA（miR-212-5p、miR-449a、miR-375和miR-578）在前列腺癌和癌旁組織的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除miR-375表達(dá)明顯升高外，其余三種miRNA在前列腺癌和癌旁組織中表達(dá)差異不明顯。接著我們用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測了c

17、ircCDK13上miR-212-5p和miR-449a潛在的結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)circCDK13上包含2個(gè)miR-212-5p的潛在結(jié)合位點(diǎn)和4個(gè)miR-449a的結(jié)合位點(diǎn)，暗示circCDK13可能與miR-212-5p/449a具有某些相互作用。為了探究circCDK13在細(xì)胞內(nèi)是否與miR-212-5p/449a結(jié)合，我們用標(biāo)記生物素的circCDK13探針轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞，oligo-pulldown后再用qRT–PCR分析其富集的

18、miRNAs，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，miR-212-5p和miR-449a的富集量表達(dá)量明顯增加，證明circCDK13在細(xì)胞內(nèi)可以與miR-212-5p和miR-449a結(jié)合。我們繪制了circCDK13與miR-212-5p和miR-449a結(jié)合位點(diǎn)的示意圖。為了進(jìn)一步驗(yàn)證circCDK13與miR-212-5p和 miR-449a間的相互作用，我們構(gòu)建了帶有熒光素酶活性的pmirGLO-circCDK13質(zhì)粒，將其與對照pmir-GL

19、O分別轉(zhuǎn)入PC3細(xì)胞中，測量其熒光素酶活性，然后分別轉(zhuǎn)入miR-NC、miR-212-5p、miR-449a和miR-212-5p+miR-449a，再測量其熒光素酶活性，報(bào)告基因結(jié)果顯示， pmirGLO-circCDK13的熒光素酶活性能被miR-212-5p和miR-449a模擬物抑制，同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-212-5p+miR-449a的，抑制作用更明顯。
　　2前列腺癌組織中E2F5基因表達(dá)明顯高于癌旁組織
　　為了尋找

20、miR-212-5p/449a可能的靶基因，我們利用基因微陣列芯片分析了2組前列腺癌和相對應(yīng)的癌旁非腫瘤標(biāo)本，篩選了9種基因，分別是E2F5、NAPB、HDGF、ELF3、FGF16、HINFP、UBTF、GDF11和IGFBP3。隨后我們應(yīng)用qRT-PCR證實(shí)E2F5在前列腺癌中表達(dá)明顯高于癌旁非瘤組織。
　　3前列腺癌中，circCDK13通過miR-212/449a調(diào)節(jié)E2F5基因表達(dá)
　　為了探究miR-212/44

21、9a能否調(diào)節(jié)E2F5，我們用生物信息學(xué)方法預(yù)測了miR-212-5p和miR-449a在E2F5上的潛在的結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)此位點(diǎn)在人、小家鼠和牛具有高度同源性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證E2F5與miR-212-5p和miR-449a間的相互作用，我們構(gòu)建了帶有熒光素酶活性的pmirGLO-E2F53′UTR質(zhì)粒和其突變質(zhì)粒pmirGLO-E2F53′UTR mut，將其與對照pmir-GLO分別轉(zhuǎn)入PC3細(xì)胞中，測量其熒光素酶活性，然后分別轉(zhuǎn)入mi

22、R-NC、miR-212-5p、miR-449a和miR-212-5p+miR-449a，再測量其熒光素酶活性，報(bào)告基因結(jié)果顯示，pmirGLO-E2F53′UTR的熒光素酶活性能被miR-212-5p和miR-449a模擬物抑制，同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-212-5p+miR-449a的，抑制作用更明顯。但當(dāng)E2F53′UTR端突變后，其熒光素酶活性幾乎不受miR-212-5p或miR-449a影響。說明E2F5包含miR-212-5p和miR

23、-449a的作用靶點(diǎn)。為了驗(yàn)證circCDK13與E2F5之間是否有關(guān)聯(lián)，我們做了熒光原位雜交結(jié)合免疫熒光實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)帶有綠色熒光的circCDK13和帶有紅色熒光的E2F5共同在前列腺癌中高表達(dá)，并且定位在相同位置。
　　4 E2F5促進(jìn)circCDK13表達(dá),并且形成一個(gè)反饋調(diào)節(jié)環(huán)路
　　為了探究CDK13與E2F5的關(guān)系，我們在PC3細(xì)胞中過表達(dá)E2F5后， qRT-PCR分別探測circCDK13和CDK13 mRNA

24、的表達(dá)量，與其對照組相比，circCDK13和CDK13 mRNA的表達(dá)量均明顯增加。為了進(jìn)一步探究CDK13與E2F5的關(guān)系，PC3細(xì)胞過表達(dá)E2F5后，Western blot分析CDK4，CDK13，CyclinD1，P21的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，過表達(dá)E2F5后，與細(xì)胞周期有關(guān)的CDK4，CDK13，CyclinD1表達(dá)均增高，與抑制細(xì)胞周期有關(guān)的P21表達(dá)顯著下降。為了證實(shí)E2F5與 CDK13之間的相互作用，我們做了熒光

25、報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，構(gòu)建了包含CDK13啟動子的報(bào)告載體（pGL3-CDK13-Promoter），與不同量的pcDNA3.1-E2F5質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)隨著pcDNA3.1-E2F5轉(zhuǎn)染量的增加，pGL3-CDK13-Promoter熒光素酶活性越來越強(qiáng)。以上結(jié)果表明，E2F5表達(dá)增加既可以促進(jìn)細(xì)胞周期增加 CDK13表達(dá)，也可以競爭性結(jié)合 miR-212-5p和miR-449a，從而減少CDK13的降解。
　　5 circ

26、CDK13通過激活E2F5促進(jìn)前列腺癌腫瘤發(fā)生
　　以上結(jié)果顯示了在體外E2F5可以增加CDK13的表達(dá)，那么體內(nèi)CDK13是否能調(diào)控E2F5的表達(dá)呢？為了考證這個(gè)假說，我們構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)circCDK13的慢病毒，通過處理PC3細(xì)胞并獲得穩(wěn)定表達(dá)circCDK13細(xì)胞株，細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)增后并收集細(xì)胞重懸于1×PBS溶液中，濃度定量為1×106 cell/50μl PBS，取50μl于裸鼠皮下注射荷瘤， circCDK13細(xì)胞組和對照

27、組分別接種于裸鼠右側(cè)和左側(cè)背部皮下，21天后處死裸鼠，觀察腫瘤大小，生物發(fā)光圖像顯示過表達(dá)circCDK13的腫瘤（右側(cè)）明顯大于其對照組（左側(cè)）。切除腫瘤后觀察，結(jié)果同上。飼養(yǎng)裸鼠期間，分別于6、9、12、18、21天測量腫瘤大小，繪制腫瘤生長曲線，亦發(fā)現(xiàn)過表達(dá)circCDK13的腫瘤增長明顯快于對照組。Western blot分析瘤組織中E2F5和PCNA的表達(dá)顯示，其表達(dá)顯著高于對照組。說明circCDK13可以促進(jìn)E2F5的表達(dá)

28、。為了進(jìn)一步確定circCDK13與E2F5的關(guān)系，我們用荷瘤組織石蠟切片做了免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，過表達(dá)circCDK13瘤組織中E2F5和PCNA表達(dá)顯著增加，P21表達(dá)顯著下降，與Western blot結(jié)果一致。
　　6前列腺癌中circCDK13/miR212-5p/449a/E2F5調(diào)控環(huán)路示意圖
　　綜合上述結(jié)果表明，前列腺癌中circCDK13表達(dá)上調(diào)，并發(fā)揮miRNA海綿作用吸附 miR212-5

29、p/449a， miR212-5p/449a水平的下降，解除miR212-5p/449a對E2F5的靶向抑制，繼而使CDK13基因激活，產(chǎn)生更多的circCDK13，最終形成一個(gè)circCDK13/miR212-5p/449a/E2F5正反饋回路促進(jìn)前列腺癌的發(fā)生發(fā)展。
　　小結(jié)：
　　前列腺癌組織中E2F5基因表達(dá)明顯高于癌旁組織，miR-212-5p/449a則在前列腺癌組織中低表達(dá)，circCDK13通過吸附miR21

30、2-5p/449a調(diào)控E2F5表達(dá)，而E2F5又反過來調(diào)節(jié)CDK13的表達(dá)，形成一個(gè)正反饋環(huán)路。
　　結(jié)論：
　　1前列腺癌組織中circCDK13表達(dá)明顯高于癌旁組織。
　　2 circCDK13通過調(diào)控細(xì)胞周期影響腫瘤細(xì)胞增殖。
　　3前列腺癌組織中E2F5基因表達(dá)明顯高于癌旁組織。
　　4前列腺癌中，circCDK13通過miR-212/449a調(diào)節(jié)E2F5基因表達(dá)。
　　5 E2F5促進(jìn)CDK