circAMOTL1在前列腺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、前列腺癌（Prostate cancer，PCa）是男性泌尿生殖系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤，預(yù)后較差，且容易復(fù)發(fā)，對(duì)男性健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類新型非編碼 RNA，大量存在于真核細(xì)胞中，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，高度保守，具有一定的組織和細(xì)胞特異性。相關(guān)研究表明circRNA與多種疾病有關(guān)，特別是在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色。但是關(guān)于circRNA在前列腺癌中作用機(jī)制的研究尚無(wú)報(bào)道。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Ep

2、ithelial-to-mesenchymal transition，EMT）是上皮樣細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變的過(guò)程，它在腫瘤的遷移和侵襲過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，但是其相關(guān)作用機(jī)制尚未研究清楚。CircRNA在EMT調(diào)控過(guò)程中的作用機(jī)制亦不清楚。本研究旨在闡明circAMOTL1在前列腺癌中的作用及其在EMT調(diào)控過(guò)程中的作用機(jī)制，為后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。通過(guò)對(duì)前列腺癌及前列腺增生組織中circRNA的篩選，發(fā)現(xiàn)circAMOTL1在前列腺癌

3、組織中表達(dá)下調(diào)；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，circAMOTL1可以調(diào)節(jié)EMT標(biāo)志基因的表達(dá)。本研究將對(duì)circAMOTL1在前列腺癌中的表達(dá)及其在EMT調(diào)控過(guò)程中的作用機(jī)制進(jìn)行研究，為circRNA在前列腺癌診治中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
　　目的：
　　闡明circAMOTL1在前列腺癌中的表達(dá)及其在EMT調(diào)控過(guò)程中的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1收取PCa及前列腺增生(Benign Prostatic Hyperplasia

4、, BPH)臨床標(biāo)本，分別提取組織的RNA，及病理切片進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。
　　2設(shè)計(jì)環(huán)狀RNA連接處的divergent primers和convergent primers并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)circRNAs在前列腺組織及細(xì)胞中的表達(dá)，并對(duì)表達(dá)明顯的circRNA進(jìn)行全長(zhǎng)擴(kuò)增并測(cè)序確定序列信息。同時(shí)使用circAMOTL1連接處的熒光探針對(duì)PCa組織及BPH組織進(jìn)行熒光原位雜交，檢測(cè)circAMOTL1的表達(dá)差異。
　　3

5、利用正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞PC3細(xì)胞、LNCaP細(xì)胞、DU145細(xì)胞的RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 PCR，用以檢測(cè)circAMOTL1在前列腺非癌細(xì)胞和癌細(xì)胞中的表達(dá)差異。細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒GFP-circAMOTL1和GFP-Ctl，檢測(cè)兩組circAMOTL1的表達(dá)。隨后進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)和創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)GFP-circAMOTL1對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的影響。
　　4細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染si-Ctl、si-ci

6、rcAMOTL1和 si-linear AMOTL1，檢測(cè)circAMOTL1和AMOTL1 mRNA的表達(dá)。之后再進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)和創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)si-circAMOTL1對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的影響。
　　5 PC3細(xì)胞過(guò)表達(dá)或敲低circAMOTL1，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)，同時(shí)進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)EMT標(biāo)志基因的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1檢測(cè)環(huán)狀RNA在PCa組織中的表達(dá)。

7、>　　通過(guò)RT-PCR，在cDNA組能檢測(cè)到條帶而gDNA（基因組DNA）組檢測(cè)不到條帶表明該環(huán)狀RNA存在，并且能被擴(kuò)增出來(lái)。PCR結(jié)果顯示，circAMOTL1表達(dá)最明顯。隨后對(duì)circAMOTL1的全長(zhǎng)進(jìn)行擴(kuò)增，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳及桑格測(cè)序進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，circAMOTL1全長(zhǎng)有1072個(gè)堿基，連接處序列與預(yù)測(cè)的序列一致。
　　2 CircAMOTL1在前列腺癌組織的表達(dá)下調(diào)。
　　qRT-PCR結(jié)果顯示，與B

8、PH組織相比，circAMOTL1在PCa組織中的表達(dá)水平顯著降低。熒光原位雜交結(jié)果顯示，circAMOTL1探針的熒光強(qiáng)度在PCa組織中顯著低于BPH組織，表明circAMOTL1在PCa組織中表達(dá)下調(diào)。
　　3 CircAMOTL1過(guò)表達(dá)能夠抑制前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。
　　在正常及不同的前列腺癌細(xì)胞株中檢測(cè) circAMOTL1的表達(dá)， qRT-PCR結(jié)果顯示，前列腺癌PC3細(xì)胞中的circAMOTL1表達(dá)水平明顯低

9、于正常前列腺上皮細(xì)胞及其它癌細(xì)胞。為了研究circAMOTL1的功能，構(gòu)建了 circAMOTL1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。在 PC3細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒GFP-circAMOTL1和GFP-Ctl，提取RNA并進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)組的circAMOTL1表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組。該結(jié)果說(shuō)明質(zhì)粒能夠成功在PC3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)circAMOTL1。過(guò)表達(dá)circAMOTL1后并進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，circAMO

10、TL1過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)顯著減少。創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)circAMOTL1能夠明顯降低 PC3細(xì)胞的遷移能力。上述結(jié)果說(shuō)明過(guò)表達(dá)circAMOTL1能夠抑制前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。
　　4敲低circAMOTL1能夠促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。
　　PC3細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染si-Ctl、si-circAMOTL1和si-linear AMOTL1后，提取細(xì)胞RNA并反轉(zhuǎn)錄，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)circAMOTL

11、1和AMOTL1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示，si-linear AMOTL1能降低 circAMOTL1和AMOTL1 mRNA的水平，而si-circAMOTL1只能降低circAMOTL1的表達(dá)。該結(jié)果表明si-circAMOTL1能特異敲低circAMOTL1，而不影響線性AMOTL1的表達(dá)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，circAMOTL1敲低組的細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)明顯高于對(duì)照組。創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低組的細(xì)胞遷移能力比對(duì)

12、照組強(qiáng)。上述結(jié)果說(shuō)明敲低 circAMOTL1能夠促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。
　　5 CircAMOTL1參與調(diào)控EMT。
　　普通光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果顯示，circAMOTL1過(guò)表達(dá)后細(xì)胞表現(xiàn)為上皮樣細(xì)胞形態(tài)，而敲低 circAMOTL1后細(xì)胞表現(xiàn)為間質(zhì)樣細(xì)胞形態(tài)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)circAMOTL1顯著上調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白 E-cadherin和 Claudin1的表達(dá)，而下調(diào)

13、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Vimentin的表達(dá)。相反，敲低circAMOTL1后上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin和Claudin1表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Vimentin表達(dá)上調(diào)。而兩組的β-catenin的表達(dá)水平均無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論：
　　1 CircAMOTL1存在于前列腺組織中，并在癌變過(guò)程中表達(dá)下調(diào)。
　　2過(guò)表達(dá)circAMOTL1抑制而敲低circAMOTL1促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。
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