MicroRNAlet-7a在前列腺癌細胞中的表達和作用機制研究.pdf

1、目的：
　　miRNAs是一種內(nèi)源性的，長約22nt的非編碼小RNA，通過與靶基因3’UTR互補序列特異性的結(jié)合而發(fā)揮重要的調(diào)控作用。許多文獻報道m(xù)iRNAs對腫瘤的診斷和治療都有重要意義。以往的研究表明miRNAlet-7在肺癌中能明顯抑制腫瘤細胞的生長，它可以通過下調(diào)原癌基因RAS/c-MYC和HMGA-2的蛋白表達而抑制腫瘤細胞的增殖。但是，let-7a在前列腺癌中的表達情況和作用機制卻鮮有研究報道。因此，我們運用體內(nèi)和體外

2、方法研究let-7a在前列腺癌中的表達情況和它對腫瘤細胞增殖的影響，并驗證細胞周期相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子E2F2和CCND2是否是let-7a的靶基因。
　　材料與方法：
　　1.細胞培養(yǎng)與組織收集：人前列腺癌細胞系LNCaP、DU145、PC3及PrEC(前列腺上皮細胞)置于10％胎牛血清中培養(yǎng)；26例前列腺癌及周圍正常組織標本來源于西京醫(yī)院泌尿外科。
　　2.質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染：let-7a用miRNA分離試劑盒擴增及純化。擴

3、增后的產(chǎn)物克隆進真核表達質(zhì)粒EcoRI/PstI位點，構(gòu)建表達質(zhì)粒pcDNA3-let-7a-GFP。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前列腺癌細胞系PC3并篩選后得到穩(wěn)定表達let-7a的前列腺癌細胞系PC3-let-7a-GFP及空白對照PC3-GFP。同時用人工合成的let-7amimics和空白對照（NC）或者let-7a抑制劑let-7a-inhibitor以及空白對照NCinhibitor轉(zhuǎn)染PC3和LNCaP。
　　3.總RNA提取和實時

4、定量反轉(zhuǎn)錄PCR:按試劑盒操作提取細胞和組織總RNA，用相應(yīng)的引物擴增let-7a，CCND2和E2F2。
　　4.細胞活性檢測分析：將NC、let-7a、NCinhibitor和let-7ainhibitor轉(zhuǎn)染前列腺癌細胞性PC3和LNCaP，觀察5天內(nèi)細胞的生長情況。與3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽孵育后將細胞溶解于二甲基亞砜中，并以490nm波長測量吸光度。
　　5.軟瓊脂克隆實驗：將離散的

5、PC3-let-7a-GFP和PC3-GFP細胞至于上層鋪有0.7％軟瓊脂的12孔板中，18天后計數(shù)集落大于100um的分離到下層含1.2％的軟瓊脂中的細胞數(shù)量。
　　6.細胞周期分析：收集72小時后轉(zhuǎn)染NC、let-7a(mimics)、NCinhibitor和let-7ainhibitor的PC3細胞和LNCaP細胞，用磷酸鹽緩沖液洗滌并至于4°C酒精過夜后，重懸于500ul碘化丙啶中。流式細胞儀檢測G0-G1期、S期和G2-

6、M中的細胞含量。
　　7.雙熒光素酶報告基因分析：用相應(yīng)的引物擴增E2F2和CCND2的3’UTR，并對其與let-7a的結(jié)合位點進行點突變獲得變異型的E2F2和CCND2的3’UTR。將E2F2和CCND2的3’UTR分別克隆進表達質(zhì)粒pGL3中。與pRL-TK，NC、let-7a(mimics)或者pRL-TK，NCinhibitor和let-7ainhibitor共轉(zhuǎn)染HEK293細胞；同時將變異型的E2F2和CCND2的3

7、’UTR分別克隆進表達質(zhì)粒pGL3中，與pRL-TK，NC、let-7a(mimics)共轉(zhuǎn)染HEK293細胞。檢測熒光素酶活性降低情況。
　　8.免疫印跡分析：前列腺癌和周圍正常組織蛋白以及轉(zhuǎn)染let-7a和對照的細前列腺癌細胞系行蛋白電泳分離后至置于醋酸纖維膜上分離蛋白。用相應(yīng)的一抗抗體孵育過夜。繼而用相應(yīng)FITC標記的二抗孵育并洗滌后用遠紅外成像系統(tǒng)檢測E2F2、CCND2、CDK4、K-ras的蛋白含量，β-actin作為

8、內(nèi)參。
　　9.裸鼠荷瘤實驗：各五只裸鼠皮下注射～1×106的PC3-let-7a-GFP細胞或者PC3-GFP細胞，4周后處死裸鼠并觀察成瘤情況。對腫瘤標本進行免疫印跡分析E2F2和CCND2的蛋白表達情況。
　　結(jié)果：
　　1.let-7a在前列腺癌組織和癌細胞中表達下降。實時定量PCR結(jié)果顯示對比正常組織，let-7a在前列腺癌組織中的含量下降約43％；對比于正常前列腺上皮細胞PrEC，let-7a的含量在LNC

9、ap中下降30％，在PC3和DU-145中下降約50％(*p<0.05;**p<0.01)。
　　2.let-7a抑制腫瘤細胞生長，并誘發(fā)細胞周期G0-G1阻滯。轉(zhuǎn)染let-7a質(zhì)粒后，PC3-let-7a-GFP中l(wèi)et-7a含量增加3倍以上，轉(zhuǎn)染let-7amimics后PC3細胞中l(wèi)et-7a含量增加10倍以上(p<0.01)，表明轉(zhuǎn)染成功?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后，細胞克隆形成能力下降40％(p<0.01)；而MTT生

10、長曲線提示無論是PC3細胞還是LNCaP細胞，與對照組相比，轉(zhuǎn)染let-7a后細胞生長出現(xiàn)明顯抑制(p<0.05)；流式細胞周期分析表明轉(zhuǎn)染let-7a后，PC3和LNCaP細胞中G0-G1期細胞含量分別增加約30％和16％；相應(yīng)S期細胞含量分別減少～50％和20％；而與對照組相比，轉(zhuǎn)染let-7ainhibitor的PC3和LNCaP細胞中G0-G1期細胞含量分別減少約23％和19％；相應(yīng)S期細胞含量分別增加約33％和25％(*p<0

11、.05;**p<0.01)。
　　3.let-7a直接靶向調(diào)控E2F2和CCND2。轉(zhuǎn)染let-7a(mimics)和變異型CCND2或E2F2后的HEK293細胞中熒光素酶活性未見改變；而轉(zhuǎn)染野生型CCND2和E2F2的HEK293細胞中熒光素酶活性分別降低約30％和50％(**p<0.01)。相對于對照組，轉(zhuǎn)染let-7ainhibitor的HEK293細胞中熒光素酶活性未見明顯改變，表明E2F2和CCND2直接受let-7a

12、靶向調(diào)控，而HEK293細胞中的let-7a含量對實驗無明顯影響。
　　4.let-7a抑制E2F2、CCND2mRNA和蛋白質(zhì)表達。實時定量PCR提示對比PrEC和正常前列腺組織，E2F2和CCND2的mRNA在前列腺癌細胞系LNCaP、PC3、DU-145和癌組織中表達增加(*p<0.05;**p<0.01)；而轉(zhuǎn)染let-7a后，PC3和LNCaP細胞中E2F2和CCND2的mRNA含量明顯下調(diào)(*p<0.05;**p<0.

13、01)。免疫印跡分析表明轉(zhuǎn)染前后CDK4的蛋白表達量未見明顯差異；E2F2和CCND2蛋白含量在前列腺癌組織中表達明顯高于對照，而轉(zhuǎn)染let-7a后，前列腺癌細胞系中E2F2和CCND2以及k-ras的蛋白含量明顯降低。
　　5.let-7a體內(nèi)抑制前列腺癌細胞的生長裸鼠荷瘤4周后，腫瘤質(zhì)量和腫瘤/小鼠體積都有明顯差異，轉(zhuǎn)染let-7a的裸鼠腫瘤明顯小于對照組(p<0.01)。腫瘤中E2F2和CCND2蛋白含量都明顯減低。

14、　　結(jié)論：
　　1.實時定量PCR結(jié)果顯示let-7a在前列腺癌組織和癌細胞中表達下降。
　　2.我們成功構(gòu)建了包含let-7a的表達質(zhì)粒pcDNA3-let-7a-GFP，轉(zhuǎn)染并成功篩選穩(wěn)定表達let-7a的前列腺癌細胞PC3-let-7a-GFP。
　　3.轉(zhuǎn)染let-7a后，PC3和LNCaP細胞生長和克隆形成能力受到明顯抑制，細胞周期分析發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)G1/S期阻滯。
　　4.雙熒光素酶報告基因檢測發(fā)現(xiàn)let-