殼聚糖對去乙酰真菌環(huán)氧乙酯合成的調節(jié)作用.pdf

1、海洋微生物生境特殊，具有獨特的代謝途徑。海洋微生物的次級代謝產物是新藥物研究開發(fā)的重要資源。如何提高微生物的次級代謝產物的產量，是目前海洋微生物開發(fā)亟待解決的問題。近年來，使用誘導子來刺激代謝途徑已經成為提高目的產物產量的主要策略之一。
　　 本論文嘗試采用誘導子來提高海洋抗腫瘤候選新藥去乙酰真菌環(huán)氧乙酯(Deacetylmycoepoxydiene，縮寫為DAM)的產量，并對誘導機制進行初步的探索。DAM是紅樹植物內生真菌A1

2、23(Phomopsis sp.A123)產生的一種骨架新穎的環(huán)氧二烯類化合物。前期研究表明，DAM具有較強的細胞毒性，對Raji細胞株IC50為3.0g/mL，對胃癌AGS細胞株IC50為1.0μg/mL，具有較好的藥用開發(fā)前景。但是野生菌株發(fā)酵產量極低，PDA固體發(fā)酵產量僅為0.8mg/L，限制了對DAM的進一步研究。
　　 在前期搖床培養(yǎng)基質優(yōu)化的基礎上，本文選擇和制備了16種誘導子，研究了它們在液體培養(yǎng)條件下對DAM高產

3、突變株139的DAM產量的影響，結果表明，白色假絲酵母菌體制備物和殼聚糖具有顯著的正調節(jié)作用。采用CCD設計響應面實驗，得到了殼聚糖誘導子的最佳誘導條件：殼聚糖接種時間為發(fā)酵后的144h、濃度100mg/L。DAM最高產量可比空白對照提高36％。進一步對誘導條件進行優(yōu)化，DAM的終產量可以提高1.5倍，為工業(yè)生產上提高DAM產量、縮短生產周期奠定了基礎。
　　 為了研究殼聚糖對菌株139誘導過程中發(fā)生的生理生化變化，本文對實驗組

4、和對照組發(fā)酵液分別進行了生物量、DAM產量、殘?zhí)堑臏y定以及菌體形態(tài)觀察的實驗。結果顯示殼聚糖的加入促進了菌株的一些生理變化，尤其是菌體提前產生了自溶現象。
　　 采用Real-timePCR等技術，初步探討了殼聚糖提高DAM產量的可能機制。通過簡并引物設計，從菌株139中克隆出信號轉導蛋白的保守片段，得到G蛋白的α亞基、MAPK蛋白和PKA蛋白的保守序列；通過Real-time PCR檢測得出G蛋白的表達量在誘導2h內基本沒有變

5、化，5h下調了5.89倍。而MAPK蛋白在誘導1h、2h、5h時分別下調了1.49、2.28、10.57倍；推測誘導作用可能是通過信號轉導途徑將外界信號傳遞到細胞核，導致相關基因轉錄水平變化。其次，在前人研究基礎上，探究殼聚糖的加入對DAM合成相關酶的表達變化影響，發(fā)現酯酶、細胞色素P450單氧合酶和NAD依賴性的脫水酶這3種后修飾酶在發(fā)酵第168h和第216h時伴隨著DAM產量的提高均有不同程度的上調。因此推測殼聚糖提高DAM產量的機