葒草苷對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷自噬作用及其JNK-ERK通路的研究.pdf

1、缺血性腦卒中是中國(guó)居民死亡的主要原因之一，具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率的特點(diǎn)，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。臨床上治療腦缺血的主要方式是恢復(fù)血流供應(yīng)，但血流恢復(fù)的同時(shí)又會(huì)引起再灌注腦損傷，因此受到醫(yī)學(xué)界廣泛的關(guān)注。腦缺血再灌注損傷過(guò)程中有許多機(jī)制的參與，如氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、線粒體損傷等，這些因素相互作用，引起一系列病理級(jí)聯(lián)反應(yīng)，造成腦組織損傷，目前仍缺乏有效的治療手段。
　　隨著對(duì)自噬作用研究的不斷深入，從自噬角度探討藥物對(duì)腦

2、缺血再灌注損傷的作用及機(jī)制成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。自噬是生命體特殊的分解代謝途徑，對(duì)維持細(xì)胞生存及穩(wěn)態(tài)有重要作用。正常生理狀態(tài)下，自噬處于較低的水平，當(dāng)受到缺血或缺氧等條件刺激時(shí)被激活，研究表明自噬對(duì)細(xì)胞具有雙重作用，適度激活自噬可以保護(hù)細(xì)胞，而過(guò)度自噬可能會(huì)對(duì)細(xì)胞造成一定的損傷。目前，自噬的研究還不太成熟，其具體分子機(jī)制及信號(hào)通路仍未完全闡明。
　　葒草苷屬碳苷黃酮類(lèi)單體，是中國(guó)傳統(tǒng)中藥金蓮花、葒草和竹葉的主要活性成分，臨床

3、上常用于治療冠心病、心絞痛、心血瘀阻等癥。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，葒草苷對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，可顯著降低大鼠腦梗死體積和改善缺血腦組織的病理形態(tài)結(jié)構(gòu)，其保護(hù)作用機(jī)制是通過(guò)抗炎、抗氧化以及降低興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性實(shí)現(xiàn)的。但到目前為止，葒草苷是否通過(guò)干預(yù)自噬發(fā)揮對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用尚未研究。因此，本文從自噬角度研究葒草苷對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，并探討其參與的JNK/ERK信號(hào)通路，期望為葒草苷的臨床用藥提供

4、新的作用靶點(diǎn)。
　　本實(shí)驗(yàn)采用改良的Longa線栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，大鼠麻醉后使其右側(cè)大腦缺血，在缺血2h后進(jìn)行再灌注，待大鼠蘇醒后進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型大鼠出現(xiàn)不能完全伸展手術(shù)對(duì)側(cè)前爪或向手術(shù)對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈、傾倒等神經(jīng)缺損癥狀，評(píng)分在1～3分左右，表明MCAO模型的成功建立。
　　1Beclin1與LC3在腦缺

5、血再灌大鼠腦缺血區(qū)的動(dòng)態(tài)表達(dá)
　　大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham）、腦缺血再灌注(I/R)組，其中I/R組分為再灌注1h、3h、6h、12h、24h、48h和72h各亞組，Sham組大鼠只分離頸總動(dòng)脈，不插入栓線。各組大鼠分別于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)斷頭取腦，利用免疫組織化學(xué)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和western-blot法，檢測(cè)不同再灌時(shí)間點(diǎn)大鼠缺血側(cè)腦皮層Beclin1與LC3的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、蛋白和mRNA的表達(dá)水平，以此選取合適的時(shí)間點(diǎn)做后

6、續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　免疫組化結(jié)果表明，與Sham組相比，I/R組大鼠Beclin1與LC3的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著增多(P＜0.05，P＜0.01)，再灌注開(kāi)始1～6h增加緩慢，12h時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞最多，并且持續(xù)到24h，之后陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)降低。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，與Sham組相比，I/R組大鼠Beclin1與LC3的mRNA表達(dá)水平均提高，具有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)，且24h表達(dá)最高，24h之后兩者mRNA表達(dá)降低。We

7、stern-blot結(jié)果顯示，與Sham組相比，I/R組大鼠Beclin1與LC3的相對(duì)蛋白表達(dá)均增加，具有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)，再灌注開(kāi)始呈逐漸增加的趨勢(shì)，于再灌注24h達(dá)到峰值，之后LC3的表達(dá)維持在較高的水平，而B(niǎo)eclin1的表達(dá)有所降低。
　　2葒草苷對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷自噬作用的研究
　　大鼠隨機(jī)分為Sham組、I/R組、I/R+葒草苷給藥組(Ori)、I/R+葒草苷+雷帕霉素組（Ori+R

8、AP）、I/R+葒草苷+3-甲基腺嘌呤組(Ori+3-MA)。給藥方式為腹腔注射，大鼠于腦缺血再灌注24h，采用TTC染色檢測(cè)大鼠腦梗死體積;western-blot法檢測(cè)大鼠缺血側(cè)腦皮層目的蛋白Beclin1、LC3以及磷酸化的Akt和mTOR的表達(dá)水平。
　　TTC結(jié)果表明，與Sham組相比，I/R組大鼠腦梗死體積增加，具有顯著性差異(P＜0.01);Ori給藥后大鼠腦梗死體積顯著降低(P＜0.05，P＜0.01);與Ori給

9、藥組相比，提前給予自噬誘導(dǎo)劑RAP組腦梗死體積有所增加(P＜0.05)，而給予自噬抑制劑3-MA組腦梗死體積降低（P＜0.05）。Western-blot結(jié)果顯示，與Sham組相比，I/R組自噬蛋白Beclin1和LC3以及p-Akt和p-mTOR的表達(dá)增多，具有顯著性差異(P＜0.01);Ori給藥后以上蛋白的表達(dá)均顯著降低(P＜0.05，P＜0.01);與Ori給藥組相比，提前給予自噬誘導(dǎo)劑RAP組自噬蛋白Beclin1和LC3以及

10、p-Akt表達(dá)顯著增加(P＜0.05)，而p-mTOR蛋白的表達(dá)無(wú)顯著性差異，給予自噬抑制劑3-MA組Beclin1、p-Akt和p-mTOR蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.05)，而LC3蛋白的表達(dá)變化不顯著。
　　3葒草苷對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷JNK/ERK信號(hào)通路的研究
　　大鼠隨機(jī)分為Sham組、I/R組、I/R+葒草苷組(Ori)、I/R+葒草苷+JNK抑制劑組(Ori+JNK)、I/R+葒草苷+ERK抑制劑組(Ori+

11、ERK)。利用western-blot法檢測(cè)大鼠腦缺血再灌注24h目的蛋白Beclin1、LC3以及磷酸化的JNK和ERK的表達(dá)水平。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Sham組相比，I/R組大鼠自噬蛋白Beclin1、LC3以及p-ERK和p-JNK表達(dá)增多，具有顯著性差異(P＜0.01);與I/R組相比，Ori給藥后以上蛋白的表達(dá)均顯著降低(P＜0.05，P＜0.01);與Ori給藥組相比，給予JNK抑制劑組自噬蛋白Beclin1和LC3