新城疫病毒誘導細胞合胞體死亡機制的研究.pdf

1、新城疫病毒（newcastle disease virus, NDV）是一種天然的溶瘤病毒，能選擇性引起腫瘤細胞死亡，同時，NDV的血凝素-神經氨酸酶（hemagglutinin-neuramidinase，HN）和融合蛋白（fusion protein，F(xiàn)）可以誘導細胞融合，形成多核巨細胞，即細胞合胞體。本課題以NDV強毒株——Italien株為研究對象，探討其感染腫瘤細胞引起的合胞體形成及其死亡機制。
　　本論文分為三個部分：

2、
　　第一部分：NDV Italien對腫瘤細胞的殺傷作用
　　目的：檢測NDV感染腫瘤細胞后引起的細胞病變效應和對腫瘤細胞的殺傷率。
　　方法：利用無特定病原種蛋培養(yǎng)NDV Italien，3天后收集雞胚尿囊液，濃縮純化得到病毒懸液。采用TCID50（median tissue culture infective dose）法測定病毒懸液的含量。然后以不同劑量的NDV感染腫瘤細胞，應用光學顯微鏡觀察病毒引起的細胞病變

3、效應，同時測定其對腫瘤細胞的殺傷作用。
　　結果：NDV經雞胚培養(yǎng)和超速離心純化濃縮后，獲得了高滴度的NDV病毒懸液（1010-1011 TCID50/ml）。MTT細胞毒性實驗顯示，病毒感染腫瘤細胞后細胞存活率顯著下降，表明NDV Italien毒株對腫瘤細胞有很強的細胞殺傷能力。同時蘇木精-伊紅染色顯示，病毒感染腫瘤細胞引起了細胞與細胞之間廣泛的融合，最終形成了大量細胞合胞體。
　　第二部分：NDV Italien誘導細

4、胞合胞體的形成及死亡
　　目的：研究NDV誘導細胞融合形成的合胞體的命運及作用機制。
　　方法：NDV Italien感染肝癌細胞SMMC-7721，采用TUNEL染色法檢測合胞體死亡。利用JC-1檢測病毒感染腫瘤細胞后細胞的線粒體膜電位；同時檢測細胞ATP的水平變化以及NDV病毒粒子和線粒體的共定位關系。
　　結果：病毒感染細胞后形成的合胞體TUNEL染色呈陽性，表明合胞體細胞中的DNA發(fā)生斷裂；通過JC-1檢測，在

5、熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，合胞體細胞的線粒體膜電位明顯下降；ATP水平的顯著降低（P<0.01），表明合胞體的死亡與線粒體密切相關。但透射電鏡實驗并未發(fā)現(xiàn)病毒在線粒體的定位，提示病毒引起的線粒體改變，可能不是通過病毒與線粒體直接發(fā)生相互作用的方式引起的。
　　第三部分：NDV的HN和F蛋白在細胞合胞體形成及死亡中的協(xié)同誘導作用
　　目的：探討NDV Italien包膜蛋白HN和F在合胞體形成及死亡中的協(xié)同作用。
　　方法：利用

6、HN和F的真核表達質粒pcDNA-HN和pcDNA-F共轉染BSR-T7/5細胞，活細胞動態(tài)觀察細胞融合。pcDNA-HN和pcDNA-F共轉染SMMC-7721或BSR-T7/5細胞，通過間接免疫熒光技術、PI染色以及TUNEL染色來檢測細胞合胞體的形成和死亡。同時檢測兩種質粒共轉染的BSR-T7/5細胞中的ATP水平。利用透射電鏡觀察共轉染細胞的超微結構。
　　結果：活細胞動態(tài)觀察顯示質粒 pcDNA-HN和pcDNA-F共轉

7、染BSR-T7/5細胞后細胞發(fā)生融合且形成的合胞體逐漸死亡。免疫熒光實驗顯示，質粒pcDNA-HN和pcDNA-F共轉染腫瘤細胞SMMC-7721或BSR-T7/5細胞后，細胞發(fā)生融合并形成合胞體；SMMC-7721細胞共轉染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，PI染色表明合胞體呈陽性，提示合胞體細胞發(fā)生死亡；同樣，BSR-T7/5細胞共轉染后，經PI和TUNEL染色表明合胞體形成并最終死亡；而單獨轉染pcDNA-HN或pcDNA-F則沒有引起細胞死亡

8、，同時對照組中聚乙二醇雖然能引起細胞膜融合，但未見合胞體細胞死亡。在質粒共轉染的BSR-T7/5細胞中，與對照組相比，兩種質粒共轉染引起ATP水平顯著降低（P<0.05），說明病毒膜蛋白的共同作用影響線粒體代謝。上述結果提示，NDV感染引起的合胞體死亡與HN和F蛋白的協(xié)同作用有關，并且這一效應可能與病毒基因組的復制以及單純的細胞膜融合無關。利用透射電鏡進一步發(fā)現(xiàn)，共轉染組融合細胞內出現(xiàn)了較多的典型自噬空泡，而單轉染組則未見有明顯的自噬空