基因Ⅶ型新城疫病毒主要毒力蛋白功能研究及應(yīng)用.pdf

1、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)的毒力由多個(gè)基因共同調(diào)控，這些基因主要包括F、HN、L和NP基因。本研究首先以基因Ⅶ型NDV F蛋白作為研究對(duì)象，對(duì)F蛋白的保守序列457-461位氨基酸進(jìn)行單點(diǎn)突變，獲得不同的突變體蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，突變體F蛋白與野生型F蛋白均可定位在細(xì)胞表面。除N460位點(diǎn)以外的其余4個(gè)F蛋白突變體在同型HN蛋白的協(xié)同作用下，可以顯著地增強(qiáng)細(xì)胞融合能力，表現(xiàn)為合胞體數(shù)量的增多和融合面

2、積的擴(kuò)大;此外，單獨(dú)轉(zhuǎn)染F蛋白突變體質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)T458位和G459位氨基酸的突變，可以不依賴于HN蛋白獨(dú)立誘導(dǎo)膜融合。通過反向遺傳操作技術(shù)，成功拯救了5株突變病毒，分別是rNDV-V457D、rNDV-T458D、rNDV-G459D、rNDV-N460D和rNDV-L461D，且獲救的毒株可穩(wěn)定傳代。NDV F基因突變病毒在DF-1細(xì)胞上的增殖速度和最高滴度均低于rNDV，其中，rNDV-T458D、rNDV-L461D與rNDV相比

3、，在感染24h時(shí)病毒滴度具有顯著差異(p＜005)，在感染40h和48h時(shí)，rNDV-T458D和rNDV-G459D與rNDV相比均具有極顯著差異(p＜001)，并且rNDV-T458D和rNDV-G459D的病毒毒力由強(qiáng)毒變?yōu)橹械榷玖?。此外，上述NDV F基因突變株感染SPF雞后分別檢測病毒在臟器和拭子中的含量，發(fā)現(xiàn)各突變株在不同組織樣品中的病毒滴度均低于rNDV，rNDV呈現(xiàn)全身性高病毒滴度分布，其中在脾臟和法氏囊中病毒含量最高，

4、小腸中也有較高的病毒滴度;而rNDV-T458D、rNDV-G459D和rNDV-L461D主要存在于免疫器官脾臟和法氏囊中，rNDV-V457D在小腸中病毒含量最高。因此，與rNDV相比，F(xiàn)蛋白的上述5個(gè)點(diǎn)突變降低了各突變株病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制能力。
　　L蛋白是NDV中最大的結(jié)構(gòu)蛋白，它除了具有5'端加帽、帽依賴的甲基化轉(zhuǎn)移酶活性及3，端添加多聚腺苷酸尾巴功能以外，還參與病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，與病毒的毒力緊密相關(guān)。對(duì)L蛋白的

5、保守結(jié)構(gòu)域K-D-K-E進(jìn)行突變，成功獲救了4株NDVL蛋白突變株，其病毒毒力顯著減弱，由強(qiáng)毒株均突變?yōu)槿醵局辏彝蛔儾《驹贒F-1細(xì)胞中的增殖能力低于rNDV。同時(shí)，將這4株病毒連續(xù)傳至15代，測序結(jié)果證明突變位點(diǎn)依然存在，可以穩(wěn)定遺傳。突變?nèi)醵局昝庖逽PF雞21d后用基因Ⅶ型強(qiáng)毒NDV-74株攻毒，均可完全保護(hù)，其中rNDV-E1954Q組攻毒后，未檢測到病毒排毒。在此突變毒株的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了F蛋白突變的重組病毒rNDV-F+E19

6、54Q，該重組病毒的毒力顯著低于野生型NDV，免疫SPF雞21d后攻毒，亦可完全保護(hù)。攻毒后檢測排毒情況和臟器中病毒含量，發(fā)現(xiàn)各臟器中病毒載量及排毒量均低于LaSota免疫組。
　　此外，本研究缺失NP蛋白抗原表位的18個(gè)氨基酸和突變F蛋白裂解位點(diǎn)，構(gòu)建基因Ⅶ型NDV負(fù)標(biāo)記株，獲救的病毒具有毒力低、滴度高和免疫原性好等優(yōu)點(diǎn)。免疫SPF雞21d后攻毒，可完全保護(hù)，且排毒量和臟器病毒載量均低于LaSota對(duì)照組。本研究的結(jié)果為NDV新