安化黑茶提取物抗癌功能的初步分子機理研究.pdf

1、實驗目的:
　　近年來，黑茶在茶葉市場中占有的份額越來越高，也得到了消費者的一致好評，原因主要有兩方面，一方面是黑茶的獨特口感和優(yōu)良品質，另一方面是其具有很好的保健功能。黑茶的保健功效主要有降脂、抗氧、抗癌和調節(jié)腸道免疫功能等。隨著全球癌癥發(fā)病率的不斷攀升，抗癌作用已成為黑茶功能研究的熱點。我省有著豐富的安化黑茶資源，研究安化黑茶提取物的抗癌功能可以極大地提高其附加值，本實驗以結直腸癌細胞作為實驗模型，對安化黑茶的抗癌功能進行評估

2、并探討其作用的分子機理，為日后人們的飲食、功能性食品、保健產品的開發(fā)提供理論依據。
　　實驗方法:
　　本課題擬從黑茶提取物抑制結直腸癌細胞增殖和促使結直腸癌細胞凋亡兩個方面對黑茶抗癌功能進行評估。利用MTS方法，分析安化黑茶提取物對結直腸癌細胞HCT116增殖的影響;利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析黑茶提取物對癌細胞相關基因表達的影響;采用報道基因系統(tǒng)確定黑茶提取物對轉錄因子AP-1和NF-κB活性的影響;采用

3、磷酸化抗體分析黑茶提取物對MAPK信號通路的影響等。通過Hoechst33258熒光染色法分析黑茶提取物對結直腸癌細胞調亡的影響，確定其對細胞形態(tài)、細胞核的變化;通過流式細胞技術進一步分析安化黑茶提取物對結直腸癌細胞調亡的影響;采用Western blot方法，分析安化黑茶提取物對Bcl-2家族蛋白和Caspase活化的影響。闡明安化黑茶提取物抑制直腸癌細胞增殖和促進凋亡的分子機理。
　　實驗結果:
　　(1)安化黑茶提取物

4、對結直腸癌細胞增殖具有抑制作用。
　　本課題首先采用MTS細胞存活實驗分析了安化黑茶提取物對結直腸癌細胞HCT116增殖的影響，采用0μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和400μg/mL濃度安化黑茶提取物作用48 h后，發(fā)現安化黑茶提取物能抑制HCT116的增殖活動，且隨著濃度增大，抑制作用增強。
　　(2)安化黑茶提取物能調控細胞周期關鍵靶基因的表達
　　安化黑茶提取物處理結直腸癌細胞，提取總RNA，通過

5、實時熒光定量PCR(qRT-PCR)發(fā)現，安化黑茶提取物能抑制細胞周期關鍵靶基因cyclinD1和VEGF的mRNA表達水平，且呈劑量依賴性的關系。
　　細胞周期素依賴的蛋白激酶抑制子(CDKI)與癌細胞的增殖密切相關。實驗發(fā)現安化黑茶提取物對p16、p21、p27和p53均具有明顯的提升作用，且呈劑量依賴性，提示安化黑茶提取物能抑制CDK2/CDK4/CyclinD復合物的活性，抑制結直腸癌細胞的增殖。但安化黑茶提取物對p15、

6、p18和p19的表達沒有影響。
　　(3)安化黑茶提取物對結直腸癌細胞AP-1和NF-κB轉錄活性的影響
　　轉錄因子AP-1和NF-κB在癌的發(fā)生、發(fā)展中起非常重要的作用。在p16、p21、p27、p53、cyclin D1和VEGF等基因的啟動子區(qū)域，均存在AP-1和NF-κB的DNA結合位點，AP-1和NF-κB是調控CDKI基因表達的重要轉錄因子，同時，也是cyclin D1基因的表達的主要調控因子。將帶有熒光素酶的

7、AP-1和NF-κB報道質粒通過Lipofectamin2000導入HCT116細胞，不同安化黑茶提取物處理結直腸癌細胞后，檢測熒光酶的活性，結果發(fā)現安化黑茶提取物既能抑制轉錄因子AP-1的活性，也能抑制轉錄因子NF-κB的活性，提示安化黑茶提取物可能通過抑制AP-1和NF-κB的轉錄活性，從而下調對cyclin D1和VEGF等表達，提升對p16、p21、p27和p53等的表達。
　　(4)安化黑茶提取物對結直腸癌細胞MAPK信

8、號通路的影響
　　MAPK信號通路是癌細胞中異常活化的信號通路，與癌細胞的增殖和凋亡密切相關。轉錄因子AP-1和NF-κB是MAPK下游激活的靶蛋白，如JNK能直接活化c-Jun，從而激活AP-1。不同安化黑茶提取物處理結直腸癌細胞后，提取總蛋白Western blot分析發(fā)現，安化黑茶提取物能抑制ERK1/2和JNK的磷酸化，且呈劑量依賴性的關系;相反，安化黑茶提取物能促使p38MAPK的磷酸化。結果提示安化黑茶提取物能抑制癌細

9、胞增殖的信號通路，同時，也能激活與癌細胞凋亡相關的信號通路。
　　(5)安化黑茶提取物促進結直腸癌細胞凋亡
　　不同濃度的黑茶提取物處理結直腸癌細胞后，結果發(fā)現，低濃度的黑茶提取物不能導致結直腸癌細胞HCT116凋亡，高濃度黑茶提取物能顯著促進結直腸癌細胞凋亡，在熒光染色實驗中發(fā)現有細胞核凝集、濃縮、核碎裂，出現凋亡小體等，通過流式細胞儀進一步證實黑茶提取物能促進結直腸癌細胞凋亡。
　　(6)安化黑茶提取物對結直腸癌細

10、胞凋亡相關基因表達的影響
　　Bcl-2超家族對于維持細胞的穩(wěn)態(tài)非常重要，Bcl-2超家族既包含有促細胞調亡的蛋白如Bax，也包括抑制細胞調亡的蛋白如Bcl-2。不同濃度的黑茶提取物處理結直腸癌細胞后，Western blot分析發(fā)現黑茶提取物能促進Bax基因表達，同時，抑制Bcl-2基因表達，黑茶提取物打破了Bax/Bcl-2比例，促進結直腸癌細胞凋亡，導致Caspase-3活化。
　　結論:
　　基于以上實驗研究，