Aroclor1254通過(guò)p38 MAPK途徑調(diào)節(jié)連接蛋白周轉(zhuǎn)影響血睪屏障功能.pdf

1、目的:多氯聯(lián)苯(Polychlorinated biphenyl，PCB)作為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的典型代表，是一類廣泛應(yīng)用到日常生活中的持久性環(huán)境有機(jī)污染物。能通過(guò)空氣、水-、食物等多種途徑侵入人體，給人類健康造成危害，由該類有機(jī)污染物帶來(lái)的健康危害已引起了世界各國(guó)學(xué)者的廣泛關(guān)注。近年來(lái)，在PCB的毒性效應(yīng)研究中，其對(duì)生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)的損害日益受到重視，并且尤以其對(duì)男性生殖功能的影響為焦點(diǎn)?，F(xiàn)已有文獻(xiàn)報(bào)道，PCB暴露可能導(dǎo)致

2、睪丸重量和精子數(shù)量減少，在人類流行病學(xué)研究中也發(fā)現(xiàn)樣本血清中的PCBs含量和睪酮水平之間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。然而，PCBs影響精子發(fā)生的具體作用機(jī)制目前還未被完全闡明。
　　血睪屏障(blood-testis barrier，BTB)位于曲細(xì)精管和毛細(xì)血管之間，是生精上皮中以Sertoli細(xì)胞(Sertoli cell，SC)間的緊密連接為基礎(chǔ)形成的結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)是既作為一道有效的免疫屏障，使各期精細(xì)胞的發(fā)育在相對(duì)獨(dú)立的小室內(nèi)進(jìn)行，避免精子

3、抗體的產(chǎn)生，還避免了血液循環(huán)中的有害物質(zhì)對(duì)生精過(guò)程產(chǎn)生影響，保障了精子發(fā)生的順利進(jìn)行。因此，該結(jié)構(gòu)對(duì)雄性生殖功能具有重要的意義。
　　圍繞上述問(wèn)題，本課題選取PCB混合物Aroclor1254對(duì)雄性SD成年大鼠及體外原代培養(yǎng)的Sertoli細(xì)胞進(jìn)行染毒，評(píng)估BTB結(jié)構(gòu)及其功能的變化。通過(guò)分析BTB相關(guān)連接蛋白的表達(dá)及定位的改變，尋找Aroclor1254毒性作用的靶分子，從而揭示該化合物對(duì)BTB結(jié)構(gòu)及其功能影響的分子機(jī)制，期待為有

4、機(jī)環(huán)境污染物的生殖毒理學(xué)研究和該類化合物對(duì)人類生殖風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估以及不孕不育的預(yù)防提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　研究方法:1.本研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)選取成年90d雄性SD大鼠(250-300 g)為研究對(duì)象，腹腔注射Aroclor1254（1、3 mg/kg）或Aroclor1254(3 mg/kg)與p38 MAPK抑制劑SB203580(10μM)的混合物后，進(jìn)行:①生物素標(biāo)記的體內(nèi)BTB屏障功能檢測(cè);②制備睪丸組織冰凍切片，免疫熒光觀察BTB相關(guān)

5、連接蛋白分布的變化;③免疫印跡檢測(cè)BTB相關(guān)連接蛋白水平。2.體外實(shí)驗(yàn)原代培養(yǎng)20d雄性SD大鼠Sertoli細(xì)胞，培養(yǎng)后第3d用Aroclor1254(0-100μg/ml)處理，于不同時(shí)間點(diǎn):①測(cè)定細(xì)胞活力篩選最佳染毒濃度;②測(cè)定跨內(nèi)皮電阻(TER)值及熒光素鈉(Na-F)滲透率反映Sertoli細(xì)胞屏障功能;③免疫印跡檢測(cè)Sertoli細(xì)胞連接蛋白水平;④免疫熒光觀察Sertoli細(xì)胞連接蛋白分布;3.Caveolin依賴的胞內(nèi)轉(zhuǎn)

6、運(yùn)抑制劑膽固醇氧化酶(CO)與Aroclor1254聯(lián)合處理Sertoli細(xì)胞后，檢測(cè)以上體外指標(biāo)變化(②-④)。4.泛素蛋白連接酶Itch siRNA沉默與Aroclor1254聯(lián)合處理Sertoli細(xì)胞后，檢測(cè)以上體外指標(biāo)變化(②-④)。
　　結(jié)果:1.Aroclor1254通過(guò)p38 MAPK途徑破壞大鼠體內(nèi)BTB屏障功能。體內(nèi)BTB功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)觀察到Aroclor1254處理后生物素自生精小管基底膜向管腔的彌散距離與對(duì)照組

7、相比明顯增大，而在Arclor1254+SB203580處理組，該彌散距離與Arclor1254組相比顯著降低;免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，Aroclor1254處理后BTB相關(guān)連接蛋白o(hù)ccludin的熒光信號(hào)與對(duì)照組相比減弱，JAM-A、N-cadherin信號(hào)分散不集中，而Arclor1254+SB203580組不存在該現(xiàn)象;免疫印跡結(jié)果顯示，Aroclor1254處理組occludin表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著降低同時(shí)p38 MAPK磷酸

8、化增多，其他連接蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著變化，Arclor1254+SB203580組occludin表達(dá)量無(wú)明顯改變。2.Aroclor1254通過(guò)p38 MAPK途徑影響體外Sertoli細(xì)胞上皮屏障功能。細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Aroclor1254在10μg/ml濃度下對(duì)Sertoli細(xì)胞無(wú)顯著毒性作用，即對(duì)其存活率無(wú)明顯影響;TER及Na-F滲透率測(cè)定結(jié)果顯示，Aroclor1254處理后SC屏障功能顯著下降;免疫印跡發(fā)現(xiàn)Arolco

9、r1254處理后occludin水平降低，p38磷酸化水平升高，同時(shí)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)功能蛋白caveolin-1的水平增高;免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察到與對(duì)照組相比，Aroclor1254處理組BTB連接蛋白o(hù)ccludin信號(hào)減弱，N-cadherin、β-catenin信號(hào)分散不集中于細(xì)胞連接處。Aroclor1254+SB253580組與對(duì)照組相比無(wú)以上變化，即SB253580可以拮抗Aroclor1254對(duì)BTB的影響。3.Aroclor1254

10、-p38MAPK通過(guò)Caveolae依賴的連接蛋白胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)影響體外BTB屏障功能。TER及Na-F滲透率測(cè)定結(jié)果顯示，CO處理可部分拮抗Aroclor1254引起的體外屏障功能下降;免疫印跡結(jié)果顯示CO處理對(duì)Aroclor1254引起的occludin水平降低無(wú)影響;免疫熒光可見(jiàn)CO處理后Aroclor1254不能引起N-cadherin、β-catenin的定位變化。4.Aroclor1254-p38 MAPK通過(guò)泛素連接酶Itch下

11、調(diào)occludin蛋白水平影響體外BTB屏障功能。免疫印跡顯示Itch沉默后，Aroclor1254不能引起occludin水平降低;TER及Na-F滲透率測(cè)定結(jié)果顯示，Itch沉默可部分拮抗Aroclor1254引起的體外屏障功能下降;免疫熒光可見(jiàn)Itch沉默后Aroclor1254不能引起occludin的定位變化。
　　結(jié)論:Aroclor1254通過(guò)p38 MAPK途徑促進(jìn)caveolae依賴的連接蛋白胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)及Itch介