丁酸鈉通過p38MAPK途徑誘導γ-珠蛋白基因表達中轉錄因子的篩查及鑒定.pdf

1、背景與目的：珠蛋白生成障礙性貧血(thalassemia)是由于珠蛋白(globin)基因發(fā)生缺失或點突變等，使某種珠蛋白肽鏈合成受到抑制，導致珠蛋白肽鏈之間不平衡所引起的一組遺傳性溶血性貧血，是世界上發(fā)病率最高的單基因遺傳病，其中β-珠蛋白生成障礙性貧血在我國南方數(shù)省發(fā)病率較高。在珠蛋白生成障礙性貧血的治療上，輸血、離子螯合劑、骨髓移植和基因治療等治療方案雖然都有一定的療效，但又都存在不同的缺陷。目前倍受人們關注的γ-珠蛋白基因誘導劑

2、如丁酸鹽、羥基脲、促紅細胞生成素、曲古抑菌素A、地西他濱、氯化高鐵血紅素等可誘導出生后近乎關閉的γ-珠蛋白基因重新表達，合成胎兒血紅蛋白(fetal hemoglobin，HbF)(α2γ2)以代替成人血紅蛋白(adult hemoglobin，HbA)(α2β2)的不足，從而改善患者的臨床癥狀，但它們又面臨著自身的細胞毒性、遠期致癌作用或半衰期較短等問題。因此，迫切需要發(fā)掘一些新的激活γ-珠蛋白基因的藥物。
　　 發(fā)掘和設計更

3、合理新藥的前提是闡明藥物激活γ-珠蛋白基因重新表達的機制。雖然已經(jīng)報道了γ-珠蛋白基因誘導劑可通過活化p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)等途徑誘導γ-珠蛋白基因重新表達，但為什么p38MAPK信號途徑激活后可誘導γ-珠蛋白基因表達尚不清楚。另外，Ikuta等研究發(fā)現(xiàn)對丁酸鹽類藥物治療有效的病人γ-珠蛋白基因啟動子區(qū)DNA序列與核蛋白的相互作用發(fā)生了改變，提示轉錄因子

4、在丁酸鹽類藥物對γ-珠蛋白基因激活中可能起重要作用，但哪些轉錄因子與γ-珠蛋白基因表達有關尚不清楚。cAMP反應元件結合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)和激活轉錄因子-2(activating transcription factor2，ATF-2)屬于ATF/CREB轉錄因子家族成員，是p38MAPK信號通路的下游調節(jié)因子，而丁酸鈉可以活化p38MAPK信號途徑并誘導Gγ-珠

5、蛋白基因的重新表達已有諸多報道；GATA結合蛋白-1/珠蛋白轉錄因子-1(GATA binding protein-1/globin transcription factor-1，GATA-1)是GATA蛋白家族成員之一，GATA-1在造血干細胞(hematopoieticstem cells，HSCs)和多系祖細胞轉換點被激活，高水平的GATA-1活性是珠蛋白基因表達和紅細胞成熟所必需的。因此，深入闡明γ-珠蛋白基因誘導劑誘導γ-珠蛋

6、白基因重新表達的分子機制，特別是探索CREB、ATF-2、GATA-1等轉錄因子的作用是十分必要的。
　　 基于以上研究結果和我們課題組以前的研究也證明了p38MAPK信號途徑中磷酸化的p38有直接的誘導γ-珠蛋白基因表達的重要作用。本研究的目的是在建立選擇性p38持續(xù)高磷酸化、低磷酸化和各種對照K562細胞模型的基礎之上，進一步分析不同狀態(tài)的K562細胞核蛋白與γ-珠蛋白基因啟動子區(qū)特定DNA序列相互作用變化的差異，篩選并鑒定

7、與丁酸鈉通過p38MAPK信號途徑誘導γ-珠蛋白基因表達相關的轉錄因子。為深化對轉錄因子在γ-珠蛋白基因激活中作用的認識，闡明γ-珠蛋白基因表達的分子調控機制提供新的科學依據(jù)，為開發(fā)新藥提供新的分子靶點。
　　 方法：①細胞模型的建立和鑒定：選擇在多種誘導因素下具有向紅系分化能力的人紅白血病細胞系K562細胞作為研究對象。通過脂質體介導將pCDNA3.1質粒、pCDNA3.1-MKK3(Glu)[含可選擇性持續(xù)激活p38的絲裂原

8、活化蛋白激酶激酶-3(mitogen-activated protein kinase kinase-3，MKK3)突變體MKK3(Glu)]和pCDNA3.1-MKK3(Ala)[含可選擇性使p38低磷酸化的MKK3突變體MKK3(Ala)]重組質粒轉染K562細胞，G418篩選抗性克隆，采用PCR、RT-PCR和Western blotting等方法檢測目的基因的整合和表達、p38的表達和磷酸化水平，建立選擇性p38持續(xù)高磷酸化和低

9、磷酸化的細胞模型[分別稱為K562-MKK3(Glu)細胞和K562-MKK3(Ala)細胞)]及轉染pCDNA3.1空質粒的對照細胞模型K562-vect細胞。參照文獻報導和我們以往研究的經(jīng)驗，選擇用0.5mmol/L丁酸鈉誘導72h的K562細胞作為藥物誘導的細胞模型(丁酸鈉+K562細胞)；選擇100μmol/L羥基脲誘導72h的K562細胞作為陽性對照細胞模型(羥基脲+K562細胞)。同時設立K562親本細胞、p38特異抑制劑S

10、B203580(10μmol/L)處理1h后0.5mmol/L丁酸鈉誘導72h的K562細胞(SB+丁酸鈉+K562細胞)和SB203580(10μmol/L)處理1h的K562-MKK3(Glu)細胞(SB+K562-MKK3(Glu)細胞)作為陰性對照細胞模型。采用RT-PCR、Westernbotting和聯(lián)苯胺染色等方法對不同狀態(tài)的K562細胞模型中p38的表達和磷酸化水平、γ-珠蛋白基因和胎兒血紅蛋白的表達及聯(lián)苯胺染色陽性細胞

11、進行鑒定。②不同狀態(tài)的K562細胞對外源性Gγ-珠蛋白基因啟動子活性的影響：登錄轉錄起始位點資料庫(Database of Transcriptional Start Site，DBTSS)網(wǎng)站(http：//dbtss.hgc.jp/index.html)查找Gγ-珠蛋白基因啟動子序列。利用分子克隆技術，克隆Gγ-珠蛋白基因啟動子序列(-1350～+36)并構建熒光素酶報告基因重組質粒pGL3-Gγ，經(jīng)脂質體介導將其轉導入不同狀態(tài)的K

12、562細胞，以含人單純皰疹病毒胸苷激酶(human simplex virus-thymidine kinase，HSV-TK)啟動子并可表達海腎熒光素酶(Renilla luciferase)的phRG-TK質粒為內(nèi)對照，通過雙熒光素酶報告基因分析系統(tǒng)檢測不同狀態(tài)的K562細胞對外源性Gγ-珠蛋白基因啟動子活性的影響。③EMSA探針的設計與合成：選取Gγ-珠蛋白基因啟動子區(qū)轉錄因子(transcription factor，TF)富集

13、區(qū)寡核苷酸序列作為電泳遷移率變動分析(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)探針序列，生物素標記的雙鏈DNA探針和同序未標記的雙鏈DNA探針均由美國集成DNA技術(IntegratedDNA Technologies，IDT)公司合成。④轉錄因子的篩選、鑒定：提取不同狀態(tài)細胞模型核蛋白并定量后，通過EMSA、super-EMSA等方法篩選鑒定K562-MKK3(Glu)細胞和丁酸鈉誘導的K5

14、62細胞中與Gγ-珠蛋白基因表達相關的轉錄因子。提取不同狀態(tài)細胞模型總蛋白并定量后，通過Western blotting進一步驗證有關轉錄因子的表達和磷酸化水平。
　　 結果：①轉基因細胞模型的建立：以脂質體介導將pCDNA3.1、pCDNA3.1-MKKa(Glu)和pCDNA3.1-MKKa(Ala)真核表達重組質粒轉染K562細胞后，PCR、RT-PCR和Western blotting結果顯示：含目的基因的質粒DNA已經(jīng)

15、穩(wěn)定整合入K562細胞基因組中。與K562親本細胞和K562-vect細胞相比，K562-MKK3(Glu)細胞(F=439.816，P=0.000<0.01)和K562-MKK3(Ala)細胞(F=583.734，P=0.000<0.01)中均穩(wěn)定高表達MKK3；盡管K562-MKKa(Glu)細胞和K562-MKK3(Ala)細胞中p38在mRNA和蛋白水平表達沒有明顯變化，但K562-MKK3(Glu)細胞中p38磷酸化水平顯著升

16、高(約為K562-vect細胞的4.5倍；F=1284.587，P=0.000<0.01)，而K562-MKK3(Ala)細胞中p38磷酸化水平降低(約為K562-vect細胞的0.7倍；F=1129.629，P=0.000<0.01)。SB+K562-MKK3(Glu)細胞中p38的磷酸化又降低至K562親本細胞水平。建立了選擇性p38持續(xù)高磷酸化和低磷酸化的細胞模型(分別稱為K562-MKK3(Glu)細胞和K562-MKK3(Al

17、a)細胞)及轉染pCDNA3.1空質粒的對照細胞模型K562-vect細胞。②藥物誘導細胞模型的建立：參照文獻報導和我們以往研究的經(jīng)驗，選擇0.5mmol/L丁酸鈉誘導72h的K562細胞(丁酸鈉+K562細胞)作為藥物誘導的細胞模型；選擇100μmol/L羥基脲誘導72h的K562細胞(羥基脲+K562細胞)作為陽性對照細胞模型。結果顯示：與K562親本細胞相比，丁酸鈉+K562細胞和羥基脲+K562細胞中p38在mRNA和蛋白水平表

18、達沒有明顯變化，但丁酸鈉+K562細胞和羥基脲+K562細胞中p38磷酸化水平顯著升高(分別約為K562親本細胞的4.2和3.9倍；F=4782.087，P=0.000<0.01)，而SB+丁酸鈉+K562細胞中p38磷酸化又重新降低至K562親本細胞水平。成功建立了藥物(丁酸鈉和羥基脲)誘導的p38高磷酸化的細胞模型。③不同狀態(tài)K562細胞模型的進一步鑒定：RT-PCR、Western blotting和聯(lián)苯胺染色結果顯示：與K562

19、親本細胞和K562-vect細胞相比，K562-MKK3(Glu)細胞、丁酸鈉+K562細胞和羥基脲+K562細胞中Gγ-珠蛋白(分別約為K562-vect細胞或K562親本細胞的1.4、1.4和1.5倍；F=1815.733，P=0.000<0.01)和胎兒血紅蛋白表達(分別約為K562-vect細胞或K562親本細胞的3.5、3.4和3.5倍；F=9164.470，P=0.000<0.01)及聯(lián)苯胺染色陽性細胞(分別約為K562-v

20、ect細胞或K562親本細胞的10.5、11.3和10.5倍；F=3624.630，P=0.000<0.01)顯著增加，K562-MKK3(Ala)細胞中Gγ-珠蛋白(約為K562-vect細胞的0.8倍；P=0.000<0.01)和胎兒血紅蛋白表達(約為K562-vect細胞的0.4倍；P=0.000<0.01)及聯(lián)苯胺染色陽性細胞(約為K562-vect細胞的0.6倍；P=0.000<0.01)降低。SB+K562-MKK3(Glu

21、)細胞中Gγ-珠蛋白和胎兒血紅蛋白表達及聯(lián)苯胺染色陽性細胞均又重新降低，基本恢復至K562親本細胞水平(抑制率分別為：102.12％、100.48％和84.35％)；而SB+丁酸鈉+K562細胞中Gγ-珠蛋白和胎兒血紅蛋白表達及聯(lián)苯胺染色陽性細胞也均有明顯較降低(抑制率分別為：56.43％、60.94％和71.3％)，即仍維持較高水平。這些細胞膜型的建立為后續(xù)實驗奠定了基礎。④不同狀態(tài)K562細胞對外源性Gγ-珠蛋白基因啟動子活性的影響

22、：熒光素酶報告基因實驗結果顯示：與K562親本細胞和K562-vect細胞相比，K562-MKK3(Glu)細胞和丁酸鈉+K562細胞中熒光素酶活性顯著增加(相對活性分別約為K562-vect細胞或K562親本細胞的2.4和2.8倍；F=546.211，P=0.000<0.01)，而K562-MKK3(Ala)細胞中熒光素酶活性降低(相對活性約為K562-vecr細胞的0.7倍；P=0.000<0.01)。在K562-MKK3(Glu)

23、細胞中熒光素酶活性可被p38特異抑制劑SB203580抑制(抑制率為：99.32％)，而在丁酸鈉+K562細胞中p38特異抑制劑SB203580僅部分抑制熒光素酶活性(抑制率為：59.59％；P=0.000<0.01)。說明不同狀態(tài)的K562細胞激活外源性Gγ-珠蛋白基因啟動子能力不同。⑤轉錄因子的篩選和鑒定：EMSA和super-EMSA實驗結果顯示：在丁酸鈉通過p38MAPK途徑誘導Gγ-珠蛋白基因表達中CREB、ATF-2和GAT

24、A-1可與Gγ-珠蛋白基因啟動子區(qū)特異DNA序列相結合，其中CREB和ATF-2與Gγ-珠蛋白基因啟動子區(qū)特異DNA序列的結合可被p38特異抑制劑SB203580抑制，而p38特異抑制劑SB203580不能完全抑制GATA-1與Gγ-珠蛋白基因啟動子區(qū)特異DNA序列的結合。Western blotting結果顯示：不同狀態(tài)K562細胞模型中總CREB(F=0.687，P=0.663>0.05)和ATF-2(F=0.832，P=0.564

25、>0.05)表達沒有變化，但在K562-MKK3(Glu)細胞和丁酸鈉+K562細胞中CREB(分別約為K562-vect細胞或K562親本細胞的3.4和3.2倍；F=4051.126，P=0.000<0.01)和ATF-2(分別約為K562-vect細胞或K562親本細胞的2.5和2.9倍；F=5721.138，P=0.000<0.01)磷酸化水平顯著增加，并且可被p38特異抑制劑SB203580抑制。丁酸鈉+K562細胞中總GATA

26、-1的表達水平顯著高于其它細胞模型(約為K562親本細胞的1.9倍；F=7024.656，P=0.000<0.01)，K562-MKK3(Glu)細胞和丁酸鈉+K562細胞中GATA-1磷酸化水平顯著增加(分別約為K562-vect細胞或K562親本細胞的3.9和5.1倍；F=4028.713，P=0.000<0.01)，但K562-MKK3(Glu)細胞中GATA-1磷酸化可被p38特異抑制劑SB203580抑制(抑制率為：99.58

27、％)，而在丁酸鈉+K562細胞中p38特異抑制劑SB203580僅部分抑制GATA-1磷酸化(抑制率為：62.17％；P=0.000<0.01)。與K562親本細胞和K562-vect細胞相比，K562-MKK3(Ala)細胞中CREB、ATF-2和GATA-1磷酸化水平均顯著降低(分別約為K562-vect細胞的0.2、0.6和0.5倍；P=0.000<0.01)。
　　 結論：①成功建立了 p38持續(xù)高磷酸化和低磷酸化的K5

28、62細胞模型，進一步證實了p38MAPK信號途徑的激活在藥物誘導γ-珠蛋白基因重新表達中起重要作用。②首次證明了丁酸鈉通過p38MAPK誘導γ-珠蛋白基因表達時核蛋白與γ-珠蛋白基因啟動子區(qū)特定DNA序列相互作用增強。③首次揭示了丁酸鈉通過p38MAPK信號途徑誘導γ-珠蛋白基因表達的相關轉錄因子有CREB、ATF-2和GATA-1。這些轉錄因子在丁酸鈉通過p38MAPK信號途徑激活γ-珠蛋白基因重新表達中起重要作用。④轉基因細胞模型結

29、果提示通過p38MAPK信號途徑誘導γ-珠蛋白基因重新表達中CREB、ATF-2和GATA1的活化與p38MAPK途徑的激活密切相關。⑤丁酸鈉誘導的細胞模型結果提示丁酸鈉通過p38MAPK信號途徑激活γ-珠蛋白基因重新表達中CREB和ATF-2的活化與p38MAPK途徑的激活密切相關；GATA-1的活化除與p38MAPK途徑的激活有關外，可能還涉及到其它的機制，有待進一步研究。⑥本研究結果為闡明γ-珠蛋白基因表達的分子調控機制提供了新的