高糖環(huán)境下Sirt1通過P38-MAPK影響小鼠足細胞中TTP及炎癥因子的表達.pdf

1、背景及目的：
　　糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy,DN）作為糖尿?。╠iabetic mellitus，DM）最常見且最嚴重的并發(fā)癥之一，在歐美國家中，DN是引起終末期腎臟病（end stage renal disease，ESRD）的首位病因。糖尿病腎病早期即可發(fā)生炎性因子分泌失調(diào)控，進而通過不同的作用機制損害腎臟結(jié)構(gòu)及功能，最終加速疾病的進展。作為腎臟濾過屏障最為重要的組分，足細胞受到炎性因子損害的現(xiàn)象日

2、益受到關(guān)注。但糖尿病腎病炎癥發(fā)生機制復(fù)雜，急需探索新的治療方案來延緩糖尿病腎病的進展。
　　Sirt1（Sirtuins1）是一種營養(yǎng)及代謝相關(guān)蛋白，具有調(diào)節(jié)表觀遺傳基因沉默、抑制rRNA重組等作用。有研究指出Sirt1與足細胞的損傷關(guān)系密切，且能夠參與調(diào)控糖尿病腎病炎癥反應(yīng)，但相關(guān)機制仍需進一步探討。TTP（Tristetraprolin）是一種AREs（AU-rich elements）結(jié)合蛋白，可直接與炎癥因子TNF-α及I

3、L-6的 mRNA3’UTR的AU區(qū)段結(jié)合，進而發(fā)揮抗炎作用。TTP的蛋白量及與目的 mRNA的結(jié)合能力主要受TTP的磷酸化水平影響。TTP具有多個磷酸化位點，可被多種蛋白磷酸化。而P38-MAPK是一種可磷酸化TTP的重要酶，在多種細胞活動中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是細胞信號傳導(dǎo)的重要通路。多項研究表明，Sirt1可通過P38-MAPK信號通路參與調(diào)控炎癥反應(yīng)。而Sirt1是否能夠通過P38-MAPK信號通路來調(diào)控TTP的表達，進而參與糖尿病腎

4、病的炎癥反應(yīng)、引起足細胞損傷，尚未有研究報道。
　　本實驗從細胞水平探究Sirt1在高糖誘導(dǎo)的足細胞炎癥反應(yīng)及損傷中發(fā)揮的作用及具體機制。
　　方法：
　　體外貼壁培養(yǎng)條件永生化小鼠足細胞（conditionally immortalized mouse podocyte，MPC），先將MPC置于含10％胎牛血清、5.6mmol/L葡萄糖和4ng/ml小鼠γ-干擾素的 RPMI1640培養(yǎng)基，33℃、5%CO2細胞培養(yǎng)

5、箱中增殖培養(yǎng)；然后將MPC置于含10%胎牛血清、5.6mmol/L葡萄糖、不含小鼠γ-干擾素的RPMI1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中分化培養(yǎng)。0.25%胰酶消化，按需傳代，待細胞分化成熟后，隨機分為以下9組：
　　（1）正常糖濃度組（含5.6mmol/LD-葡萄糖）；
　?。?）甘露醇組（含5.6mmol/LD-葡萄糖+19.4mmol/LD-甘露醇）；
　　（3）高糖濃度組（含25mmol/LD-葡萄

6、糖）；
　?。?）正常糖+轉(zhuǎn)染對照組；
　　（5）正常糖+Sirt1 siRNA轉(zhuǎn)染組；
　?。?）正常糖+空白對照慢病毒組；
　?。?）正常糖+過表達Sirt1慢病毒組；
　?。?）高糖+空白對照慢病毒組；
　?。?）高糖+過表達Sirt1慢病毒組。
　　實驗處理后36h、48h收集細胞，分別提取細胞總RNA和總蛋白，然后應(yīng)用qRT-PCR和Western blot在基因及蛋白水平上檢測Sir

7、t1、P38-MAPK、TTP、足細胞標記蛋白Nephrin、Podocin、損傷因子Desmin以及炎癥因子IL-6、IL-18的表達水平。
　　結(jié)果
　　1.高糖條件下足細胞中Sirt1、TTP、Nephrin及Podocin的mRNA和蛋白表達減少(P＜0.05)，Desmin、IL-6及IL-18的mRNA和蛋白表達增多(均P＜0.05)，P38-MAPK的表達無明顯變化(P＞0.05)，而p-P38-MAPK（即磷

8、酸化的P38-MAPK）的蛋白表達增多(P＜0.05)。
　　2.細胞免疫熒光雙染色顯示，正常糖濃度及高糖條件下足細胞中P38-MAPK與TTP的表達均存在共定位現(xiàn)象。免疫共沉淀也驗證了P38-MAPK蛋白能與TTP蛋白結(jié)合。
　　3.利用siRNA下調(diào)Sirt1的表達后，和正常糖濃度組相比，足細胞中Sirt1、TTP、Nephrin及Podocin的mRNA和蛋白表達降低(P＜0.05)，Desmin、IL-6及IL-18

9、的mRNA和蛋白表達增多(均P＜0.05)，P38-MAPK的表達無明顯變化（P＞0.05），而p-P38-MAPK的蛋白表達增多(P＜0.05)。
　　4.利用慢病毒上調(diào)Sirt1的表達后，與各自未轉(zhuǎn)染慢病毒組相比，足細胞中Sirt1、TTP、Nephrin及Podocin的mRNA和蛋白表達增多(P＜0.05)，Desmin、IL-6及IL-18的mRNA和蛋白表達減少(均P＜0.05)，P38-MAPK的表達無明顯變化(P＞