VEGF165通過(guò)MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)uPA蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　本研究通過(guò)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165(Vascular endothelial growth factor165，VEGF165)刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，檢測(cè)MAPK信號(hào)通路中ERK、p38、JNK的磷酸化水平及尿激酶型纖溶酶原激活物（Urokinase-type plasminogen activator，uPA）蛋白表達(dá)變化，來(lái)

2、研究外源性VEGF165促進(jìn)HUVECs細(xì)胞uPA蛋白表達(dá)的過(guò)程中MAPK信號(hào)通路的作用。
　　方法：
　　1.驗(yàn)證VEGF165對(duì)HUVECs細(xì)胞增殖的影響：采用不同濃度的VEGF165（0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、30 ng/mL和50 ng/mL）培養(yǎng)HUVECs細(xì)胞，CCK-8(水溶性四唑鹽比色法)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。
　　2.驗(yàn)證VEGF165對(duì)uPA蛋白表達(dá)的影響：分別以10 ng/ml

3、的VEGF165培養(yǎng)液和不含VEGF165的培養(yǎng)液培養(yǎng)HUVECs細(xì)胞，24 h，48 h，72 h后采用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot，WB)法檢測(cè)各組uPA蛋白的表達(dá)。
　　3.驗(yàn)證VEGF165對(duì)MAPK信號(hào)通路的影響：分別以10 ng/ml的VEGF165培養(yǎng)基和不含VEGF165的培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVECs細(xì)胞，0 h、6 h、12 h及24 h后WB檢測(cè)各組ERK、p38、JNK磷酸化水平。
　　4.確定與u

4、PA蛋白表達(dá)相關(guān)的MAPK信號(hào)通路：為確認(rèn)ERK信號(hào)通路在VEGF165上調(diào)uPA蛋白表達(dá)過(guò)程中的作用，我們應(yīng)用該通路的特異性阻斷劑PD98059干預(yù)信號(hào)傳導(dǎo)，實(shí)驗(yàn)分組如下：control組，VEGF165處理組，PD98059預(yù)處理1 h組，PD98059預(yù)處理1 h+VEGF165組。WB檢測(cè)uPA蛋白表達(dá)及p-ERK水平；為證實(shí)p38信號(hào)通路在VEGF165上調(diào)uPA蛋白表達(dá)過(guò)程中的作用，應(yīng)用該通路的特異性阻斷劑SB203580干

5、預(yù)信號(hào)傳導(dǎo)，實(shí)驗(yàn)分組同上，WB檢測(cè)uPA蛋白表達(dá)及p-p38水平；為確認(rèn)JNK信號(hào)通路在VEGF165上調(diào)uPA蛋白表達(dá)過(guò)程中的作用，我們應(yīng)用該通路的特異性阻斷劑SP600125干預(yù)信號(hào)傳導(dǎo)，實(shí)驗(yàn)分組同上，WB檢測(cè)uPA蛋白表達(dá)及p-JNK水平。
　　5.驗(yàn)證 MAPK三條通路的交互關(guān)系：分別以50 uM PD98059、20 uMSB203580和10 uM SP600125作用于HUVECs細(xì)胞，并采用WB方法檢測(cè)各組ERK、

6、p38和JNK磷酸化水平。
　　結(jié)果：
　　1.隨VEGF165濃度增高，HUVECs細(xì)胞的光密度值（Optical Density，OD）都增高，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），VEGF165濃度為10 ng/mL時(shí)OD值達(dá)到最高，繼續(xù)升高VEGF165濃度，OD值無(wú)明顯改變（P>0.05）。
　　2.VEGF165刺激HUVECs細(xì)胞后，24 h、48 h、72 h uPA/GAPDH的相對(duì)強(qiáng)度值持

7、續(xù)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)uPA/GAPDH值無(wú)差異（P>0.05）；VEGF165組與對(duì)照組uPA/GAPDH比較，24 h無(wú)差異（P>0.05），48 h和72 h差異明顯（P<0.05）。
　　3.VEGF165培養(yǎng)HUVECs細(xì)胞后0 h、6 h、12 h和24 h檢測(cè)，結(jié)果p-ERK水平不斷增高，除0 h與6 h比較無(wú)差異，其余各時(shí)間點(diǎn)間差異明顯（p<0.05），p-p38和p-JNK水平

8、也不斷增高，各時(shí)間點(diǎn)間差異明顯（p<0.05）；而ERK、p38和JNK總蛋白水平組間無(wú)差異（p>0.05）。對(duì)照組p-ERK、p-p38和p-JNK水平各時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯變化（p>0.05）。
　　4.分別以PD98059、SB203580和SP600125預(yù)處理1 h后用VEGF165培養(yǎng)HUVECs細(xì)胞，與對(duì)照組比較，只有SB203580能抑制uPA蛋白表達(dá)（p<0.05）。
　　5.PD98059、SB203580和SP