SIRT1在多囊卵巢綜合征中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、多囊卵巢綜合征（PCOS）是一種常見的生殖內(nèi)分泌紊亂疾病，常表現(xiàn)為卵泡無周期成熟導(dǎo)致慢性無排卵，并常伴發(fā)不孕及糖脂代謝紊亂等。其發(fā)病機(jī)制除與下丘腦-垂體-卵巢軸功能失調(diào)有關(guān)，還與卵泡微環(huán)境失調(diào)，卵泡發(fā)育、成熟、閉鎖的調(diào)控失衡有關(guān)。卵巢顆粒細(xì)胞對(duì)卵泡的生長發(fā)育及卵泡微環(huán)境有重要影響，顆粒細(xì)胞凋亡增多破壞卵泡微環(huán)境，導(dǎo)致卵泡成熟障礙。
　　SIRT1是一種廣泛存在于哺乳動(dòng)物中的去乙?；?，其功能廣泛，包括對(duì)能量代謝、DNA修復(fù)、細(xì)胞壽

2、命和凋亡的調(diào)控等。SIRT1的表達(dá)受多種因子的調(diào)控，如P53、FOXO和E2F1形成的自反饋環(huán)路。此外，SIRT1參與類固醇激素合成關(guān)鍵酶的表達(dá)調(diào)控，參與哺乳動(dòng)物的生殖過程。
　　RSV是至今為止發(fā)現(xiàn)的活力最強(qiáng)的特異性SIRT1激動(dòng)劑，其功能除涉及維持機(jī)體能量平衡，并且還具有抗氧化，抗炎和抗腫瘤活性。EX-527屬于吲哚類SIRT1抑制劑，是至今發(fā)現(xiàn)的活性最強(qiáng)的選擇性SIRT1抑制劑。因此，本課題研究中選擇RSV和EX527分別作

3、為SIRT1特異性的激活劑和抑制劑。
　　目的：
　　本研究以行IVF-ET或ICSI助孕的PCOS患者為主要研究對(duì)象，對(duì)其顆粒細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，使用RSV和EX527處理顆粒細(xì)胞，通過qPCR、Western Blot、流式細(xì)胞術(shù)及化學(xué)發(fā)光法測定培養(yǎng)液中雌二醇濃度等方法，分析 SIRT1表達(dá)水平改變對(duì)細(xì)胞凋亡率以及類固醇激素合成關(guān)鍵酶的影響，初步探討 SIRT1與PCOS的潛在關(guān)系。
　　方法：
　　2016年

4、4月1日至2016年12月1日于海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行常規(guī)體外授精-胚胎移植（IVF-ET）或卵泡漿內(nèi)單精子顯微注射（ICSI）助孕的患者共114例被納入研究，根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)分組：PCOS組（57例）與對(duì)照組（57例）。收集PCOS組與對(duì)照組患者卵泡液，采用紅細(xì)胞裂解法提取卵泡液中顆粒細(xì)胞，均勻接種于6孔板中，使用含15％FBS的DMEM-F12的培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)顆粒細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后使用含100μ

5、M RSV和含100μM EX527的培養(yǎng)基換液，分別繼續(xù)培養(yǎng)12h、24h、48h后收獲細(xì)胞，同時(shí)收集培養(yǎng)液，未經(jīng)加藥處理的細(xì)胞作為對(duì)照。收獲細(xì)胞后，用 Trizol一步法提取顆粒細(xì)胞總 RNA，使用 RIPA裂解液提取顆粒細(xì)胞總蛋白，兩組中目的基因和蛋白（SIRT1、StAR、CYP17、 CYP19和 PPARγ）的表達(dá)水平由qPCR和Western Blot進(jìn)行檢測并對(duì)比分析；流式細(xì)胞術(shù)檢測各標(biāo)本細(xì)胞凋亡率， Western B

6、lot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)，采用化學(xué)發(fā)光法檢測培養(yǎng)液中E2濃度并對(duì)比分析。
　　結(jié)果：
　　1在兩組顆粒細(xì)胞中均能檢測到SIRT1的表達(dá)，PCOS中SIRT1呈低表達(dá)（P＜0.05）。使用100μM RSV處理顆粒細(xì)胞后，隨作用時(shí)間延長，兩組顆粒細(xì)胞中 SIRT1、StAR、CYP17、CYP19表達(dá)水平升高，PPARγ表達(dá)水平降低（P＜0.05）。使用100μM EX527處理顆粒細(xì)胞后，

7、隨作用時(shí)間延長，兩組顆粒細(xì)胞SIRT1、StAR、CYP17、CYP19表現(xiàn)為不同程度的表達(dá)水平降低，PPARγ表達(dá)水平升高（P＜0.05）。
　　2 RSV和EX527處理顆粒細(xì)胞后，隨作用時(shí)間延長，對(duì)照組與PCOS組顆粒細(xì)胞凋亡率均升高，EX527處理顆粒細(xì)胞后細(xì)胞凋亡率升高更明顯，且隨時(shí)間延長，與RSV處理后相比凋亡率差異更大（P＜0.05）。RSV處理后，顆粒細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)升高，Caspase-3蛋白表達(dá)降低，EX