砷通過抑制BCAT1基因增加順鉑對肝癌及肝內膽管細胞癌的殺傷作用.pdf

1、第一部分三氧化二砷通過抑制BCAT1表達增強順鉑對肝細胞癌的殺傷作用及其機制研究
　　目的:肝細胞癌(HCC)是世界上第三大癌癥，大多數(shù)患者需要幾種化療藥物的治療，然而HCC對化療藥物易產(chǎn)生耐藥性，是患者化療失敗的主要原因之一。本研究通過檢測BCAT1在HCC組織和HCC細胞株（HepG2和97H）中的表達，并進一步探討B(tài)CAT1在HCC順鉑(CDDP)耐藥中的作用及其調控機制，為ATO聯(lián)合CDDP治療HCC和藥物靶向治療HCC提

2、供新的理論依據(jù)。
　　方法:(1)運用western blot法和qRT-PCR法分別檢測HCC組織和癌旁組織、HCC細胞株（HepG2和97H）和正常肝細胞(LO2)中BCAT1的mRNA水平和蛋白水平。采用T檢驗方法比較組間有無差異。(2) HCC細胞對CDDP治療常出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，為了驗證高表達的BCAT1是否在HCC的CDDP耐藥中起到作用，首先運用小干擾RNA對HCC細胞株（HepG2和97H）中的BCAT1進行沉默，并用

3、MTT法檢測BCAT1沉默對CDDP處理過的HCC細胞活力的影響。同時，用流式細胞儀檢測BCAT1沉默對CDDP處理過的HCC細胞凋亡的影響。(3) ATO在腫瘤治療中有良好的效果，用western blot法檢測ATO處理是否可以抑制HCC細胞中BCAT1的表達，并檢測ATO和CDDP聯(lián)合處理后HCC細胞中BCAT1的蛋白水平。(4)用MTT法檢測ATO聯(lián)合CDDP處理對HCC細胞（HepG2和97H）細胞活力的影響，同時檢測BCAT

4、1過表達對ATO聯(lián)合CDDP處理過的HCC細胞(HepG2和97H)的細胞活力的影響。用流式細胞儀檢測檢測ATO聯(lián)合CDDP處理對HCC細胞凋亡的影響，并檢測BCAT1過表達對ATO聯(lián)合CDDP處理過的HCC細胞凋亡的影響。
　　結果:(1)實時熒光定量PCR結果表明HCC組織中BCAT1的mRNA水平顯著高于癌旁組織，western blot法結果也表明HCC組織中BCAT1蛋白水平顯著高于癌旁組織。然后我們用實時熒光定量PCR

5、和蛋白免疫印跡法檢測HCC細胞(HepG2和97H)和正常肝細胞(LO2)中BCAT1的mRNA水平和蛋白水平。與LO2細胞相比，HepG2和97H細胞中BCAT1的mRNA水平和蛋白水平顯著更高。(2) HepG2細胞用不同濃度的CDDP處理48小時，BCAT1 siRNA處理的HepG2細胞對CDDP表現(xiàn)出更大的敏感性，并且比對照細胞具有較低的增殖率和較高的凋亡率。類似地，在97H細胞中BCAT1的降低可以增強細胞對CDDP的化學敏

6、感性，表現(xiàn)為較低的增殖率和較高的凋亡率。(3)我們用2.5、5和10μM的ATO處理HCC細胞，并通過western blot法測定48小時BCAT1的蛋白表達。結果表明，ATO以劑量依賴性方式顯著降低HCC細胞中BCAT1的蛋白表達。此外，5μM ATO處理以時間依賴性方式抑制BCAT1表達。之前已經(jīng)描述了ATO處理降低了c-Myc表達，c-Myc其是BCAT1基因的反式作用因子。因此，HepG2細胞用5μM ATO或/和20μM C

7、DDP處理48小時后，進行western blot法測定c-Myc和BCAT1表達。結果顯示5μM的ATO抑制c-Myc和BCAT1表達。(4)當HepG2和97H細胞用5μM的ATO和20μM CDDP處理48小時。ATO處理的細胞顯示出比正常細胞更低的增殖和較高的凋亡速率。然而，外源性BCAT1過表達細胞顯示出比ATO處理的細胞更高的增殖和較低的凋亡。
　　結論:(1) HCC組織和HCC細胞株（HepG2和97H）中BCAT

8、1的mRNA和蛋白水平顯著升高。(2) BCAT1沉默可以導致HCC細胞對CDDP更敏感，表明BCAT1表達降低可以抑制HCC的CDDP耐藥。(3) ATO通過c-Myc來調節(jié)BCAT1蛋白的表達降低。(4) ATO處理可以降低HCC細胞的CDDP耐藥性，并且這種降低可以被BCAT1過表達部分逆轉，提示BCAT1可以在HCC細胞CDDP耐藥中起到一定作用。
　　第二部分三氧化二砷通過抑制BCAT1表達增強順鉑對肝內膽管癌的殺傷作用

9、及其機制研究
　　目的:肝內膽管癌（ICC）是發(fā)病率僅次于肝細胞肝癌(HCC)的原發(fā)性肝癌，約占原發(fā)性肝癌的10-15％。本研究通過研究ATO聯(lián)合CDDP化療對ICC細胞的影響，并探討B(tài)CAT1在ICC耐藥CDDP中的潛在調控機制，為ATO聯(lián)合CDDP治療ICC提供一定的臨床參考。
　　方法:(1)為了評估化療藥物敏感性，我們先用20μM CDDP處理或和5μMATO聯(lián)合處理ICC細胞（RBE和HUCCT1細胞）48小時，然

10、后用MTT法檢測ATO聯(lián)合CDDP處理對ICC細胞活力的影響。(2)為了驗證BCAT1表達是否參與ICC的CDDP耐藥，用western blot法檢測BCAT1分子和H2AX的表達，而H2AX分子用來檢測藥物處理后ICC細胞的DNA損傷。(3)為了進一步驗證BCAT1在ATO聯(lián)合CDDP化療中的作用，首先我們通過彗星實驗檢測ATO聯(lián)合CDDP對HUCCT1細胞凋亡的影響，然后運用小干擾RNA對HUCCT1細胞中的BCAT1進行沉默，最

11、后再用彗星實驗檢測BCAT1沉默對ATO聯(lián)合CDDP所誘導的細胞凋亡的影響。
　　結果:(1)CDDP單獨處理RBE細胞時，RBE細胞活力未出現(xiàn)顯著的降低;但當ATO聯(lián)合CDDP處理RBE細胞時，RBE細胞對CDDP敏感性增加，細胞增殖功能發(fā)生障礙，細胞活力明顯降低。此外，在另一株HUCCT1細胞中也發(fā)現(xiàn)相似現(xiàn)象，ATO聯(lián)合CDDP處理顯著降低HUCCT1的細胞活力。(2)單獨CDDP處理RBE細胞時對BCAT1和H2AX的蛋白水

12、平?jīng)]有明顯的影響，統(tǒng)計學沒有意義。然而，ATO聯(lián)合CDDP處理既能明顯誘導H2AX蛋白水平的升高，又能誘導BCAT1蛋白水平的降低。我們又用另一株ICC細胞株HUCCT1來驗證ATO聯(lián)合CDDP的藥物效果，實驗結果和RBE細胞很相似，ATO處聯(lián)合CDDP處理既能明顯誘導H2AX蛋白水平的升高，又能誘導BCAT1蛋白水平的降低。(3)在彗星實驗中，DNA損傷越嚴重，彗星的尾部的DNA碎片越多，彗星尾部的面積長度以及熒光強度就越大，通過測量

13、這些指標可以對DNA損傷和細胞凋亡程度進行定量分析。實驗結果顯示單獨ATO和單獨CDDP處理后，HUCCT1細胞的DNA損傷比對照組有微弱的增加，但沒有顯著性差異;而ATO聯(lián)合CDDP處理可以誘導HUCCT1細胞明顯的DNA損傷。接著用小干擾對BCAT1進行沉默，驗證BCAT1在ATO聯(lián)合CDDP所誘導的DNA損傷中的作用，結果顯示BCAT1沉默后，ATO聯(lián)合CDDP處理的ICC細胞株出現(xiàn)明顯的彗星拖尾現(xiàn)象，細胞凋亡增加。
　　結